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重叠PCR 已有8人参与
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| 做重叠PCR，最后一步怎么也合不到一起，两个片段一个三百多一个四百多。做了各种梯度，touch down等，出来目的条带，但是非常淡，而且靠近一百左右有一条小带。希望有经验的朋友帮忙。 |
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 核酸生物学实验经验 |
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zhaodahe
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4楼2014-07-31 11:32:21
zhaodahe
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ksws0465326
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:37
感谢参与，应助指数 +1
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| 个人认为，首先楼主应确认overlap两个片段，A片段下游与B片段上游部分的序列是否相同，个人觉得应该有20-40bp左右的共同序列才能进行重叠；其次，在设计和成AB两个片段时，pcr产物是否单一，浓度多少，考虑是否要进行胶回收提纯，提纯后两片段浓度是多少；再次，根据DNA聚合酶的不同，所需要加入的两个片段的模板量也会不同，50微升体系中有的酶需要加100ng以上的模板，而有的酶只需要加几ng到20几ng；再有，体系中引物浓度是否适中，根据聚合酶的不同退火，延伸的温度都有不同，如退火50-60，延伸68-72等等，pcr反应循环数30-40或者再多。再者，楼主可以试着做下模板浓度梯度。祝楼主早日成功！ |
5楼2014-07-31 11:45:47
100