| 查看: 2162 | 回复: 38 | ||||
[求助]
重叠PCR 已有8人参与
|
||||
| 做重叠PCR，最后一步怎么也合不到一起，两个片段一个三百多一个四百多。做了各种梯度，touch down等，出来目的条带，但是非常淡，而且靠近一百左右有一条小带。希望有经验的朋友帮忙。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 核酸生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有292人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有6人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
9楼2014-07-31 15:24:14
zhaodahe
专家顾问
- MolEPI: 1
- 应助: 220 (大学生)
- 金币: 1796.6
- 红花: 7
- 帖子: 461
- 在线: 378.5小时
- 虫号: 552612
- 注册: 2008-04-30
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
2楼2014-07-31 09:30:06
3楼2014-07-31 09:43:34
zhaodahe
超级版主
- MolEPI: 1
- 应助: 220 (大学生)
- 金币: 1796.6
- 红花: 7
- 帖子: 461
- 在线: 378.5小时
- 虫号: 552612
- 注册: 2008-04-30
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
4楼2014-07-31 11:32:21
ksws0465326
专家顾问
- 应助: 49 (小学生)
- 金币: 885.4
- 红花: 6
- 帖子: 124
- 在线: 74.5小时
- 虫号: 3263751
- 注册: 2014-06-09
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:37
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:37
| 个人认为，首先楼主应确认overlap两个片段，A片段下游与B片段上游部分的序列是否相同，个人觉得应该有20-40bp左右的共同序列才能进行重叠；其次，在设计和成AB两个片段时，pcr产物是否单一，浓度多少，考虑是否要进行胶回收提纯，提纯后两片段浓度是多少；再次，根据DNA聚合酶的不同，所需要加入的两个片段的模板量也会不同，50微升体系中有的酶需要加100ng以上的模板，而有的酶只需要加几ng到20几ng；再有，体系中引物浓度是否适中，根据聚合酶的不同退火，延伸的温度都有不同，如退火50-60，延伸68-72等等，pcr反应循环数30-40或者再多。再者，楼主可以试着做下模板浓度梯度。祝楼主早日成功！ |
5楼2014-07-31 11:45:47
6楼2014-07-31 11:59:13
7楼2014-07-31 12:02:37
zhaodahe
主管区长
- MolEPI: 1
- 应助: 220 (大学生)
- 金币: 1796.6
- 红花: 7
- 帖子: 461
- 在线: 378.5小时
- 虫号: 552612
- 注册: 2008-04-30
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
8楼2014-07-31 12:04:34
smdsfy
实习版主
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 790.7
- 红花: 2
- 帖子: 73
- 在线: 79.2小时
- 虫号: 1285261
- 注册: 2011-05-04
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
10楼2014-07-31 16:19:07
