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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

[求助] 重叠PCR 已有8人参与

做重叠PCR,最后一步怎么也合不到一起,两个片段一个三百多一个四百多。做了各种梯度,touch down等,出来目的条带,但是非常淡,而且靠近一百左右有一条小带。希望有经验的朋友帮忙。
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-07-31 11:45:47
个人认为,首先楼主应确认overlap两个片段,A片段下游与B片段上游部分的序列是否相同,个人觉得应该有20-40bp左右的共同序列才能进行重叠;其次,在设计和成AB两个片段时,pcr产物是否单一,浓度多少,考虑是否要进 ...

嗯嗯,序列确认过了,没问题的,片段也很纯,只是没测过浓度。很好的意见,值得参考,谢谢。也祝你一切顺利。
6楼2014-07-31 11:59:13
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:29
应该是做overlap PCR吧?不知道你overlap的序列多长?模板浓度如何?另外,100bp左右的条带如果是一坨,可能是引物。
2楼2014-07-31 09:30:06
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-31 09:30:06
应该是做overlap PCR吧?不知道你overlap的序列多长?模板浓度如何?另外,100bp左右的条带如果是一坨,可能是引物。

嗯,是的,序列大概在750左右,模板浓度没有测过,但是能清晰的看到,也不低,我觉得也是引物,现在是尝试各种都不行,P出来的条带都很暗
3楼2014-07-31 09:43:34
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-07-31 20:21:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 09:43:34
嗯,是的,序列大概在750左右,模板浓度没有测过,但是能清晰的看到,也不低,我觉得也是引物,现在是尝试各种都不行,P出来的条带都很暗...

如果PCR不好弄,可以增加overlap的长度,直接把两个小片段连到一起;或者以较弱的目的片段(750bp)的基础上再一次尝试扩增,反正750bp不容易产生突变。
4楼2014-07-31 11:32:21
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