应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠PCR
51/1返回列表
查看: 2010  |  回复: 38
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

[求助] 重叠PCR 已有8人参与

做重叠PCR，最后一步怎么也合不到一起，两个片段一个三百多一个四百多。做了各种梯度，touch down等，出来目的条带，但是非常淡，而且靠近一百左右有一条小带。希望有经验的朋友帮忙。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢
1楼 2014-07-31 09:15:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:37
个人认为，首先楼主应确认overlap两个片段，A片段下游与B片段上游部分的序列是否相同，个人觉得应该有20-40bp左右的共同序列才能进行重叠；其次，在设计和成AB两个片段时，pcr产物是否单一，浓度多少，考虑是否要进行胶回收提纯，提纯后两片段浓度是多少；再次，根据DNA聚合酶的不同，所需要加入的两个片段的模板量也会不同，50微升体系中有的酶需要加100ng以上的模板，而有的酶只需要加几ng到20几ng；再有，体系中引物浓度是否适中，根据聚合酶的不同退火，延伸的温度都有不同，如退火50-60，延伸68-72等等，pcr反应循环数30-40或者再多。再者，楼主可以试着做下模板浓度梯度。祝楼主早日成功！
赞一下 回复此楼
5楼2014-07-31 11:45:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 39 个回答

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:29
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2014-07-31 09:30:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-31 09:30:06
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。

嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-31 09:43:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-31 20:21:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 09:43:34
嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗...

如果PCR不好弄，可以增加overlap的长度，直接把两个小片段连到一起；或者以较弱的目的片段（750bp）的基础上再一次尝试扩增，反正750bp不容易产生突变。
赞一下 回复此楼
4楼2014-07-31 11:32:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 39 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭