18楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-08-01 09:59:49
假设：A基因的引物为A1/A2,B基因的引物为B1/B2,A2/B1中重叠部分的TM=48℃，A1/B2的TM=61℃，按正常PCR体系，20ul体系。
step1：不加引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp ...

20楼: Originally posted by leonaliu2013 at 2014-08-01 10:56:48
重叠PCR引物特别重要，我同时做四个片段，两两重叠，有两个一次就成功了，另外两个一个多月了，还融不上。就是引物特异性不好

19楼: Originally posted by xxooxxoo at 2014-08-01 10:48:02
同学 ，你那里的啊，我也在做重叠pcr，方便的话联系一下，相互学习一下！

18楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-08-01 09:59:49
假设：A基因的引物为A1/A2,B基因的引物为B1/B2,A2/B1中重叠部分的TM=48℃，A1/B2的TM=61℃，按正常PCR体系，20ul体系。
step1：不加引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp ...

22楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 11:12:36
我之前做的两两重叠很顺利，就最后一步P出来的很淡，现在正根据虫友们的意见调整呢 ，不知道你片段大小，我之前的都是一百到四百，有的一次出来了，有的把模板稀释或者减少模板和引物量也出来了。...

25楼: Originally posted by leonaliu2013 at 2014-08-01 11:19:55
重叠PCR会有假阳性，就是你上面那条看似很淡的带，一旦你切胶回收，酶切之后，你再跑个电泳，很可能又变回两条带了。我那个就是，那个就是引物的问题，搭接上了，但是根本没扩增，是假的。...

26楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 11:22:05
啊？还可以这样啊，你的片段多大？我得一共750左右...

24楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 11:19:24
哦，是不是我理解错了，你说的循环还是和普通的一样，每一步的234小步循环，之后72℃ 7min，是这样吧？...

28楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-08-01 11:48:41
是的...

27楼: Originally posted by leonaliu2013 at 2014-08-01 11:47:23
我那个比你的大，一个450bp，一个1600bp。...