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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
18楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-08-01 09:59:49
假设:A基因的引物为A1/A2,B基因的引物为B1/B2,A2/B1中重叠部分的TM=48℃,A1/B2的TM=61℃,按正常PCR体系,20ul体系。
step1:不加引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s(我重叠后的片段1200bp ...

咱们平时不是都在循环完了以后加72℃ 7min,这个是直接就加在循环里了,我想问下有什么区别,或者有什么其他用意吗?
21楼2014-08-01 11:05:04
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
20楼: Originally posted by leonaliu2013 at 2014-08-01 10:56:48
重叠PCR引物特别重要,我同时做四个片段,两两重叠,有两个一次就成功了,另外两个一个多月了,还融不上。就是引物特异性不好

我之前做的两两重叠很顺利,就最后一步P出来的很淡,现在正根据虫友们的意见调整呢 ,不知道你片段大小,我之前的都是一百到四百,有的一次出来了,有的把模板稀释或者减少模板和引物量也出来了。
22楼2014-08-01 11:12:36
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
19楼: Originally posted by xxooxxoo at 2014-08-01 10:48:02
同学 ,你那里的啊,我也在做重叠pcr,方便的话联系一下,相互学习一下!

可以啊,论坛里好多虫友都很好呢,我问了这个问题很多虫友给出意见,大家都在互相交流
23楼2014-08-01 11:13:59
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
18楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-08-01 09:59:49
假设:A基因的引物为A1/A2,B基因的引物为B1/B2,A2/B1中重叠部分的TM=48℃,A1/B2的TM=61℃,按正常PCR体系,20ul体系。
step1:不加引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s(我重叠后的片段1200bp ...

哦,是不是我理解错了,你说的循环还是和普通的一样,每一步的234小步循环,之后72℃ 7min,是这样吧?
24楼2014-08-01 11:19:24
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)


泡菜肉丝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-23 20:25:58
引用回帖:
22楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 11:12:36
我之前做的两两重叠很顺利,就最后一步P出来的很淡,现在正根据虫友们的意见调整呢 ,不知道你片段大小,我之前的都是一百到四百,有的一次出来了,有的把模板稀释或者减少模板和引物量也出来了。...

重叠PCR会有假阳性,就是你上面那条看似很淡的带,一旦你切胶回收,酶切之后,你再跑个电泳,很可能又变回两条带了。我那个就是,那个就是引物的问题,搭接上了,但是根本没扩增,是假的。
25楼2014-08-01 11:19:55
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
25楼: Originally posted by leonaliu2013 at 2014-08-01 11:19:55
重叠PCR会有假阳性,就是你上面那条看似很淡的带,一旦你切胶回收,酶切之后,你再跑个电泳,很可能又变回两条带了。我那个就是,那个就是引物的问题,搭接上了,但是根本没扩增,是假的。...

啊?还可以这样啊,你的片段多大?我得一共750左右
26楼2014-08-01 11:22:05
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)

引用回帖:
26楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 11:22:05
啊?还可以这样啊,你的片段多大?我得一共750左右...

我那个比你的大,一个450bp,一个1600bp。
27楼2014-08-01 11:47:23
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shyh1983

金虫 (小有名气)

引用回帖:
24楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 11:19:24
哦,是不是我理解错了,你说的循环还是和普通的一样,每一步的234小步循环,之后72℃ 7min,是这样吧?...

是的
28楼2014-08-01 11:48:41
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
28楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-08-01 11:48:41
是的...

嗯,那我下午试试看吧,多谢。
29楼2014-08-01 11:53:49
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

引用回帖:
27楼: Originally posted by leonaliu2013 at 2014-08-01 11:47:23
我那个比你的大,一个450bp,一个1600bp。...

哦,你的片段比我的大多了
30楼2014-08-01 11:54:51
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