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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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泡菜肉丝

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[求助] 重叠PCR 已有8人参与

做重叠PCR，最后一步怎么也合不到一起，两个片段一个三百多一个四百多。做了各种梯度，touch down等，出来目的条带，但是非常淡，而且靠近一百左右有一条小带。希望有经验的朋友帮忙。
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1楼 2014-07-31 09:15:45
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leonaliu2013

兑换贵宾

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
★
泡菜肉丝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-23 20:25:58
引用回帖:
22楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 11:12:36
我之前做的两两重叠很顺利，就最后一步P出来的很淡，现在正根据虫友们的意见调整呢 ，不知道你片段大小，我之前的都是一百到四百，有的一次出来了，有的把模板稀释或者减少模板和引物量也出来了。...

重叠PCR会有假阳性，就是你上面那条看似很淡的带，一旦你切胶回收，酶切之后，你再跑个电泳，很可能又变回两条带了。我那个就是，那个就是引物的问题，搭接上了，但是根本没扩增，是假的。
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25楼2014-08-01 11:19:55
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zhaodahe

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:29
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。
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2楼2014-07-31 09:30:06
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泡菜肉丝

超级版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-31 09:30:06
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。

嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗
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3楼2014-07-31 09:43:34
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zhaodahe

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-31 20:21:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 09:43:34
嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗...

如果PCR不好弄，可以增加overlap的长度，直接把两个小片段连到一起；或者以较弱的目的片段（750bp）的基础上再一次尝试扩增，反正750bp不容易产生突变。
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4楼2014-07-31 11:32:21
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