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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠PCR
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 11:54:51
哦，你的片段比我的大多了...

我以前做过两个1100bp的片段融合成2200bp的片段，一次就成功了。条带很亮。我觉得就是引物好。但是融合的中间那对引物根本没法变，没法换引物，所以，只能换两端的。所以，完全是听天由命的节奏。
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31楼2014-08-01 11:58:06
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
31楼: Originally posted by leonaliu2013 at 2014-08-01 11:58:06
我以前做过两个1100bp的片段融合成2200bp的片段，一次就成功了。条带很亮。我觉得就是引物好。但是融合的中间那对引物根本没法变，没法换引物，所以，只能换两端的。所以，完全是听天由命的节奏。...

是啊，没办法，那你就先一个一个p,然后再把这两个小的融合，最后再和你之前P出来的融合
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32楼2014-08-01 12:05:23
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)
引用回帖:
32楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 12:05:23
是啊，没办法，那你就先一个一个p,然后再把这两个小的融合，最后再和你之前P出来的融合...

是呀，重叠PCR真心不好做。
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33楼2014-08-01 12:27:43
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smdsfy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 21:47:06
必须切胶纯化吗，我的两个片段跑胶看的话也很纯，没有其他杂带...

对，关键还有引物及引物及引物二聚体的影响 啊
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34楼2014-08-01 12:58:29
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1.确定你的Overlap区域是否真的OK？
2.两个小片段你测序确认过？
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35楼2014-08-04 08:50:58
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madam1020

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-31 09:30:06
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。

你好，我也要做overlap ,我的序列500多，两个片段的opt温度，一个是60多，一个是58，请问，退火温度应该怎么设？谢谢
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36楼2014-08-21 20:02:27
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
36楼: Originally posted by madam1020 at 2014-08-21 20:02:27
你好，我也要做overlap ,我的序列500多，两个片段的opt温度，一个是60多，一个是58，请问，退火温度应该怎么设？谢谢...

其实引物的退火温度是算出来的，并不准，最靠谱的方法你做个退火温度的剃度，优化一下。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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37楼2014-08-21 21:07:56
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
37楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-08-21 21:07:56
其实引物的退火温度是算出来的，并不准，最靠谱的方法你做个退火温度的剃度，优化一下。
...

嗯嗯，已解决，谢谢
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38楼2014-08-23 15:55:11
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hexiabeibei

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
38楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-23 15:55:11
嗯嗯，已解决，谢谢...

请问你最终是怎么解决的OE-PCR扩增不出来的问题，我也在做，中间重合区域有30bp，先不加引物退火15个循环，后加引物退火35个循环都没有p出来，不知道是不是模板浓度不合适导致的？另外，我用的FastPfu，也不知道是不是这个酶的效率不够。多谢了，一定分享一下经验啊！
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39楼2016-01-07 10:57:45
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