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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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泡菜肉丝

超级版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[求助] 重叠PCR 已有8人参与

做重叠PCR，最后一步怎么也合不到一起，两个片段一个三百多一个四百多。做了各种梯度，touch down等，出来目的条带，但是非常淡，而且靠近一百左右有一条小带。希望有经验的朋友帮忙。
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1楼 2014-07-31 09:15:45
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zhaodahe

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

引用回帖:
36楼: Originally posted by madam1020 at 2014-08-21 20:02:27
你好，我也要做overlap ,我的序列500多，两个片段的opt温度，一个是60多，一个是58，请问，退火温度应该怎么设？谢谢...

其实引物的退火温度是算出来的，并不准，最靠谱的方法你做个退火温度的剃度，优化一下。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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37楼2014-08-21 21:07:56
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zhaodahe

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:29
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。
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2楼2014-07-31 09:30:06
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泡菜肉丝

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-31 09:30:06
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。

嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗
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3楼2014-07-31 09:43:34
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zhaodahe

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-31 20:21:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 09:43:34
嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗...

如果PCR不好弄，可以增加overlap的长度，直接把两个小片段连到一起；或者以较弱的目的片段（750bp）的基础上再一次尝试扩增，反正750bp不容易产生突变。
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4楼2014-07-31 11:32:21
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