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喜气洋洋金虫 (初入文坛)
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[交流]
Taq和KOD酶使用讨论 已有5人参与
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做定点突变PCR，扩增6千多b的片段，前三次用的Taq酶，扩增后可以看到条带，且进行了胶回收，测的DNA浓度有17.2ng/ul，用Dpn1酶切后，转化感受态。然后涂板，没有长斑，以为是浓度不够的问题，后面特意在浓度上做了富集，都没长。第四次选用了KOD酶，今天早上过来一看，有斑了。想了半天为什么，现在有两个可能，在此和同在做的小伙伴们交流一下，希望前辈们给予指导。首先，是不是因为Taq酶有在末端加上A的原因，影响了扩增片段粘性末端的环化连接。第二，是不是Taq酶不能扩增好6kb以上的片段，但是为什么有出现了目标大小的片段呢？第三，如果是浓度问题，我在第二次时，特意将循环加到了35个，后面涂板时还先富集浓缩后，再涂的。结果仍然是什么都没长。 虽然实验做过去了，但是还想回过头来问问失败的原因，不想让自己的埋头实验变成无用功。希望，同行们看帖后也帮我想想，一起交流成长。 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
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quiller2000
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5楼2014-07-13 23:02:58
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2楼2014-07-13 14:25:06
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| 我做点突变都是用的KOD，没试过Taq。虽然也有一些报道直接用Taq或Taq plus做点突变，但我认为存在一些潜在的问题，首先，普通Taq酶错配率相对较高，不如KOD等高保真酶。其次，普通Taq不是很适用于大片段扩增，我怀疑楼主看到的大小差不多的片段，恐怕具体序列也有问题，如果想探究，不妨把该条带回收送去测测序，看看3‘末端是什么样的。第三，Taq酶在末端加A，有可能造成移码突变。 |
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喜气洋洋3楼2014-07-13 16:15:16
喜气洋洋
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