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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 关于EMSA实验的一些问题
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xy656691

金虫 (正式写手)

[求助] 关于EMSA实验的一些问题 已有2人参与

1、我合成的探针是在5‘端标记的生物素，合成好的是单链。那么在PCR上退火使两条探针形成双链之后是直接使用PCR产物进行下步实验还是对PCR产物进行纯化之后再使用？
2、我使用的试剂盒是Throme的，实验步骤里说要使用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，请问这个怎么配制？由于没有加入SDS，在电泳的时候要考虑蛋白自身的电荷吗？（如何保证蛋白电泳时的方向）
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1楼 2014-07-10 15:33:10
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zhouxiaohan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
xy656691(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-16 19:48:58
1.探针需要纯化后再使用。
2.6%非变性胶配方
   30%Acr-Bis(29:1)  2.4ml
   5xTBE                 2.4ml
   ddH2O                7.2ml
   10%AP                200ul
   TEMED                10ul
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2楼2014-07-16 10:17:19
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xy656691

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxiaohan at 2014-07-16 10:17:19
1.探针需要纯化后再使用。
2.6%非变性胶配方
   30%Acr-Bis(29:1)  2.4ml
   5xTBE                 2.4ml
   ddH2O                7.2ml
   10%AP                200ul
   TEMED                10ul

谢谢，探针只有25bp大小，怎么纯化呢？一般的PCR纯化试剂盒只能纯化100bp以上的。
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3楼2014-07-16 17:38:38
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zhouxiaohan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xy656691: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很好谢谢 2014-07-18 10:49:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by xy656691 at 2014-07-16 17:38:38
谢谢，探针只有25bp大小，怎么纯化呢？一般的PCR纯化试剂盒只能纯化100bp以上的。...

只能用小片段回收试剂盒。一般的回收试剂盒回收不回来。我们用的是QIAEN的。
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4楼2014-07-17 10:16:42
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xy656691

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhouxiaohan at 2014-07-17 10:16:42
只能用小片段回收试剂盒。一般的回收试剂盒回收不回来。我们用的是QIAEN的。...

你好，我问了qiagen的代理商，他们的纯化试剂盒最小只能回收70bp的。请问你们当时的探针是多少bp？
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5楼2014-07-21 09:28:51
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zhouxiaohan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xy656691 at 2014-07-21 09:28:51
你好，我问了qiagen的代理商，他们的纯化试剂盒最小只能回收70bp的。请问你们当时的探针是多少bp？...

40bp。QIAEX II Gel Extraction Kit  从凝胶和溶液中纯化DNA片段（40 bp–50 kb）
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6楼2014-07-21 09:36:54
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xy656691

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhouxiaohan at 2014-07-21 09:36:54
40bp。QIAEX II Gel Extraction Kit  从凝胶和溶液中纯化DNA片段（40 bp–50 kb）...

可是我的只有25bp。。。
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7楼2014-07-21 09:38:38
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zhouxiaohan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by xy656691 at 2014-07-21 09:38:38
可是我的只有25bp。。。...

我建议你不回收，直接跑试试。
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8楼2014-07-22 10:37:41
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胡亚梅

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的探针是不是太短了点，为什么不弄得长一点呢，还有直接合成的探针就不用纯化了吧
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小虫虫~~
9楼2014-07-22 15:35:38
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xy656691

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 胡亚梅 at 2014-07-22 15:35:38
你的探针是不是太短了点，为什么不弄得长一点呢，还有直接合成的探针就不用纯化了吧

当时没考虑到回收这一步的问题，就弄的短了。我做了一次没有纯化的。效果还行。
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10楼2014-07-24 17:47:43
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