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[交流]
关于Transwell迁移实验的一些问题
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最近在做Transwell迁移实验，但一直不是很成功，下面有几个问题想跟大家探讨一下，还请各位虫友不吝赐教。 1、上层小室加的细胞悬液为什么要含0.5%的BSA，BSA的作用是什么。 2、下层我用的是含5%FBS的培养基，曾经用过0.4%FBS的培养基，细胞没迁移过去，下层小室FBS是不是含量越低越好。 3、还有就是transwell小室实验前需不需要怎么处理一下，比如用无血清培养基浸润半个小时什么的。 4、加完细胞悬液后一般多长时间染色观察，我看文献有说5h，但是我觉得5h根本都迁移不过去。 |
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boylover123(金币+1): 谢谢参与
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boylover123: 金币+4, 谢谢你的回答，很详细，很受用 2013-01-11 20:39:25
boylover123(金币+1): 谢谢参与
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boylover123: 金币+4, 谢谢你的回答，很详细，很受用 2013-01-11 20:39:25
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迁移和侵袭我都做过，我来答吧： 1、上层小室加的细胞悬液为什么要含0.5%的BSA，BSA的作用是什么。 答：是为了保持渗透压，不至于让上室的水分渗透到下室太多，影响了药物浓度（如果加药的话）和实验结果。也可以用1%的FBS。 2、下层我用的是含5%FBS的培养基，曾经用过0.4%FBS的培养基，细胞没迁移过去，下层小室FBS是不是含量越低越好。 不是，上室FBS含量要低于下室，FBS里除含有养分外，也含有趋化因子，FBS浓度差是细胞迁移的诱导动力。如无特殊要求，下室浓度可用细胞培养液中FBS的浓度，即10%。 3、还有就是transwell小室实验前需不需要怎么处理一下，比如用无血清培养基浸润半个小时什么的。 如果是迁移的话不用；如果是侵袭实验的话，因为transwell小室上铺有Matrigel，所以要无血清培养基侵润一到两个小时，叫做“水化基底膜” 4、加完细胞悬液后一般多长时间染色观察，我看文献有说5h，但是我觉得5h根本都迁移不过去。 这个要看细胞的迁移能力了。如果用的是正常细胞，如表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，其迁移能力较弱，需要24小时甚至更长的时间；如果是肿瘤细胞，则较快；如果是高度恶性肿瘤细胞（就是高转移肿瘤，比如人的卵巢癌、膀胱癌等），迁移能力很强，5、6个小时就能迁移过去。并且，这个跟所种的细胞数也相关，需要摸一下条件。宗旨就是：在迁移时间内，阴性对照组（不加药的情况下）只有部分细胞迁移到下室，而不是全部。我的意思是，如果时间过长，全部细胞慢慢挪，是可以都挪到下室的，这样可能导致阴性组和加药组看不出应有的差别来。当然过短也不行，只有极少的细胞迁移了，结果还是不明显，所以需要摸一下条件。 另外嘱咐几点： 一是，实验结束染色后，别忘了单独观察一下下室中是否有掉落的细胞，有时实验细胞数较多或实验时间较长（比如超过24小时），细胞在小室的底部粘不牢，掉到下室去，未能被染色，影响统计结果。若有，则下次实验可在上室底部包被FN（纤维粘连蛋白），增强粘附。尤其是用正常细胞的时候。 二是，实验结束后，尽快染色，勿让细胞风干，否则细胞会有破裂的现象，染完色后在显微镜下不好看，烂乎乎的。在这里提示一个小tip：如果用结晶紫染色，感觉细胞很多怕计数不准的话，可以用醋酸将结晶紫洗下，上酶标仪读OD（我一时忘了波长了，这个可以查一下），用以辅助验证结果。这里醋酸洗掉的只是结晶紫，细胞还在，还可以再次用结晶紫复染，显微镜下看，效果与初染几无差别 |
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14楼2012-09-29 23:36:07
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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好久了啊，呵呵 我记得应该是这样的：首先迁移的细胞要大致均匀，否则怎么都不好选（如果是侵袭实验，那么严重不均匀的实验结果本身也不可信，因为相当于某处穿了一个“洞”，然后剩下的细胞就不必降解基底膜了，直接麻溜地聚集到那里钻过去就行了）；大致均匀的前提下，选取某条直径上的五个视野拍照，然后计数，取平均值，这是一次；再选取另一条直径，结果作为第二次；第三次相同。三次的计数除以阴性对照组的计数（方法相同），得到的百分率即为迁移率。然后三次计算得到的迁移率取平均值，算标准差，得到最后结果 这是最严谨的一种~~ |
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26楼2015-09-07 18:53:57
2楼2012-09-29 11:52:51
3楼2012-09-29 16:37:45
6楼2012-09-29 17:47:01
9楼2012-09-29 20:39:01
10楼2012-09-29 21:02:01
★ ★ ★ ★
boylover123(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+3, 鼓励发帖交流 2012-09-30 08:05:12
boylover123(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+3, 鼓励发帖交流 2012-09-30 08:05:12
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迁移就是要观察癌细胞或具有迁移能力的细胞从营养贫瘠处往丰富处迁移的能力。 1、第一个问题：加BSA的作用就是要模拟小室下层加的FBS的环境，保证实验的严谨性。 2、第二个问题：FBS用平常正常的比例就行，平常应该都是10%的FBS。0.4明显太小了，跟没加一样，细胞当然不容易迁移过去。 3、在细胞悬液加到小室前，需要事先浸润。我之前就是直接浸润在有加FBS的培养基。不过我认为你说的应该更严谨些。 4、不同细胞的迁移能力不同。所以需要事先做个时间梯度，把握下大概的时间。通常我控制在10个小时左右。 |
13楼2012-09-29 23:11:05
16楼2012-09-30 19:01:58
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29楼2018-08-11 19:27:36
简单回复
2012-09-29 16:59
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boylover123(金币+1): 谢谢参与
xiejf5楼
2012-09-29 17:46
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boylover123(金币+1): 谢谢参与
2012-09-29 19:18
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boylover123(金币+1): 谢谢参与
江南的竹8楼
2012-09-29 19:36
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boylover123(金币+1): 谢谢参与
104688987711楼
2012-09-29 21:13
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boylover123(金币+1): 谢谢参与
101020507512楼
2012-09-29 21:41
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wizardfan15楼
2012-09-30 08:04
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boylover123(金币+1): 谢谢参与
janezqf21楼
2013-03-20 16:52
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