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boylover123

金虫 (初入文坛)

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[交流] 关于Transwell迁移实验的一些问题

最近在做Transwell迁移实验，但一直不是很成功，下面有几个问题想跟大家探讨一下，还请各位虫友不吝赐教。
1、上层小室加的细胞悬液为什么要含0.5%的BSA，BSA的作用是什么。
2、下层我用的是含5%FBS的培养基，曾经用过0.4%FBS的培养基，细胞没迁移过去，下层小室FBS是不是含量越低越好。
3、还有就是transwell小室实验前需不需要怎么处理一下，比如用无血清培养基浸润半个小时什么的。
4、加完细胞悬液后一般多长时间染色观察，我看文献有说5h，但是我觉得5h根本都迁移不过去。

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1楼2012-09-29 11:04:52

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凝冰897

铁杆木虫 (著名写手)

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★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
boylover123(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+3, 应助指数+1, 很详细的回答 2012-09-30 08:04:58
boylover123: 金币+4, 谢谢你的回答，很详细，很受用 2013-01-11 20:39:25

迁移和侵袭我都做过，我来答吧：

1、上层小室加的细胞悬液为什么要含0.5%的BSA，BSA的作用是什么。
答：是为了保持渗透压，不至于让上室的水分渗透到下室太多，影响了药物浓度（如果加药的话）和实验结果。也可以用1%的FBS。

2、下层我用的是含5%FBS的培养基，曾经用过0.4%FBS的培养基，细胞没迁移过去，下层小室FBS是不是含量越低越好。
不是，上室FBS含量要低于下室，FBS里除含有养分外，也含有趋化因子，FBS浓度差是细胞迁移的诱导动力。如无特殊要求，下室浓度可用细胞培养液中FBS的浓度，即10%。

3、还有就是transwell小室实验前需不需要怎么处理一下，比如用无血清培养基浸润半个小时什么的。
如果是迁移的话不用；如果是侵袭实验的话，因为transwell小室上铺有Matrigel，所以要无血清培养基侵润一到两个小时，叫做“水化基底膜”

4、加完细胞悬液后一般多长时间染色观察，我看文献有说5h，但是我觉得5h根本都迁移不过去。
这个要看细胞的迁移能力了。如果用的是正常细胞，如表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，其迁移能力较弱，需要24小时甚至更长的时间；如果是肿瘤细胞，则较快；如果是高度恶性肿瘤细胞（就是高转移肿瘤，比如人的卵巢癌、膀胱癌等），迁移能力很强，5、6个小时就能迁移过去。并且，这个跟所种的细胞数也相关，需要摸一下条件。宗旨就是：在迁移时间内，阴性对照组（不加药的情况下）只有部分细胞迁移到下室，而不是全部。我的意思是，如果时间过长，全部细胞慢慢挪，是可以都挪到下室的，这样可能导致阴性组和加药组看不出应有的差别来。当然过短也不行，只有极少的细胞迁移了，结果还是不明显，所以需要摸一下条件。

另外嘱咐几点：
一是，实验结束染色后，别忘了单独观察一下下室中是否有掉落的细胞，有时实验细胞数较多或实验时间较长（比如超过24小时），细胞在小室的底部粘不牢，掉到下室去，未能被染色，影响统计结果。若有，则下次实验可在上室底部包被FN（纤维粘连蛋白），增强粘附。尤其是用正常细胞的时候。
二是，实验结束后，尽快染色，勿让细胞风干，否则细胞会有破裂的现象，染完色后在显微镜下不好看，烂乎乎的。在这里提示一个小tip：如果用结晶紫染色，感觉细胞很多怕计数不准的话，可以用醋酸将结晶紫洗下，上酶标仪读OD（我一时忘了波长了，这个可以查一下），用以辅助验证结果。这里醋酸洗掉的只是结晶紫，细胞还在，还可以再次用结晶紫复染，显微镜下看，效果与初染几无差别