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jamy1989

木虫 (小有名气)

[求助] EMSA相关，求助已有2人参与


最近在做EMSA的竞争性实验，如图所示，从左到右。
1：1%BSA和标记DNA对照
2：蛋白和标记DNA
3：蛋白和标记DNA 另外加了50倍的竞争性DNA
4：蛋白和标记DNA，另外加了50倍的非竞争性DNA
请问第3条带子为什么变淡了，按道理有竞争性DNA上去后，标记的DNA不是应该有一部分跑在下面吗？有没有谁做过类似的实验？遇到类似的现象？怎么解释？
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qwdr
1楼2014-05-09 16:47:45
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jamy1989(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-10 08:26:48
jamy1989: 金币+5, ★有帮助 2014-05-10 14:00:43
这个还算常见。probe弥散了。你要做更细的比例梯度，寻找合适的点。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-05-10 00:47:29
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
EMSA做起来很麻烦，建议采用DPI-ELISA

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-05-10 07:24:09
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-10 00:47:29
这个还算常见。probe弥散了。你要做更细的比例梯度，寻找合适的点。

我做了蛋白浓度梯度的EMSA，在蛋白浓度低的时候是会出现探针弥散，蛋白浓度高时探针就不会弥散，上面这个图是用高浓度蛋白做的，3号条带只是变淡了，能算弥散吗？
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qwdr
4楼2014-05-10 14:03:06
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
jamy1989: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-05-11 08:28:03
引用回帖:
4楼: Originally posted by jamy1989 at 2014-05-10 14:03:06
我做了蛋白浓度梯度的EMSA，在蛋白浓度低的时候是会出现探针弥散，蛋白浓度高时探针就不会弥散，上面这个图是用高浓度蛋白做的，3号条带只是变淡了，能算弥散吗？...

probe弥散反应了一种probe-protein的中间状态，还是那么多probe，但是分布在很大范围之后，就会显得很弱。EMSA做的就是protein-polynucleotide的比例关系，你蛋白浓度低的时候能出现弥散，提高了蛋白就好了，等于提高了蛋白：核酸比例，竞争的时候加入竞争probe，不就等于降低蛋白：核酸比例么？
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5楼2014-05-10 19:03:20
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-10 19:03:20
probe弥散反应了一种probe-protein的中间状态，还是那么多probe，但是分布在很大范围之后，就会显得很弱。EMSA做的就是protein-polynucleotide的比例关系，你蛋白浓度低的时候能出现弥散，提高了蛋白就好了，等于提 ...

首先，谢谢你，你说的很有道理！你比较一下我那2,3,4号条带，它的宽细都差不多，应该不算弥散吧，蛋白浓度低时，条带就很宽，明显很散的样子，但这个好像就是亮度变淡了，会不会是加入竞争性DNA后，有一部分标记的DNA没有进入凝胶呢？
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qwdr
6楼2014-05-11 08:27:52
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
jamy1989: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-05-11 21:28:33
引用回帖:
6楼: Originally posted by jamy1989 at 2014-05-11 08:27:52
首先，谢谢你，你说的很有道理！你比较一下我那2,3,4号条带，它的宽细都差不多，应该不算弥散吧，蛋白浓度低时，条带就很宽，明显很散的样子，但这个好像就是亮度变淡了，会不会是加入竞争性DNA后，有一部分标记的 ...

我遇到的弥散，并不是说是宽度的变化，而是分布在泳道上下很大的范围，比如从free-probe到shift之间，因为在这种蛋白：核酸比例下，形成了很多中间状态的complex，分布在泳道大小不同的位置，导致信号显得丢失了。
至于是不是没有入孔，或者是不是这一管probe压根就给少了，这更多的是操作上面的问题，空说无凭了，你要自己control，实验需要重复。
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7楼2014-05-11 14:18:16
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-11 14:18:16
我遇到的弥散，并不是说是宽度的变化，而是分布在泳道上下很大的范围，比如从free-probe到shift之间，因为在这种蛋白：核酸比例下，形成了很多中间状态的complex，分布在泳道大小不同的位置，导致信号显得丢失了。 ...

你好，之前发了几个重复的帖子，总是没看到图片，后来发现是电脑的问题。还是请你看下刚发的帖子“EMSA竞争性试验和蛋白梯度试验”。上面你提到的，蛋白核酸分布在泳道大小不同的位置，导致信号显得丢失了，这个丢失是指DNA扩散到胶的不同位置，浓度太低，以至于显色时没显出来吗？还有没有入孔，我的意思是一部分标记的DNA点到胶孔里，但是跑胶没有进入到凝胶里，以至于转膜时标记的总DNA变少，会不会有这种可能？至于probe就给少了应该不可能，量的操作应该没什么问题！
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qwdr
8楼2014-05-11 21:28:28
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cathy77yy

新虫 (初入文坛)
hello，你的EMSA做成功了吗
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9楼2014-10-11 00:22:47
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jamy1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cathy77yy at 2014-10-11 00:22:47
hello，你的EMSA做成功了吗

成功了啊！
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qwdr
10楼2014-10-11 21:02:11
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