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jamy1989

木虫 (小有名气)

[求助] EMSA相关,求助 已有2人参与


最近在做EMSA的竞争性实验,如图所示,从左到右。
1:1%BSA和标记DNA对照
2:蛋白和标记DNA
3:蛋白和标记DNA 另外加了50倍的竞争性DNA
4:蛋白和标记DNA,另外加了50倍的非竞争性DNA
请问第3条带子为什么变淡了,按道理有竞争性DNA上去后,标记的DNA不是应该有一部分跑在下面吗?有没有谁做过类似的实验?遇到类似的现象?怎么解释?
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qwdr
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jamy1989(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-10 08:26:48
jamy1989: 金币+5, 有帮助 2014-05-10 14:00:43
这个还算常见。probe弥散了。你要做更细的比例梯度,寻找合适的点。

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-05-10 00:47:29
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
EMSA做起来很麻烦,建议采用DPI-ELISA

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-05-10 07:24:09
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jamy1989

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-10 00:47:29
这个还算常见。probe弥散了。你要做更细的比例梯度,寻找合适的点。

我做了蛋白浓度梯度的EMSA,在蛋白浓度低的时候是会出现探针弥散,蛋白浓度高时探针就不会弥散,上面这个图是用高浓度蛋白做的,3号条带只是变淡了,能算弥散吗?
qwdr
4楼2014-05-10 14:03:06
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
jamy1989: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-05-11 08:28:03
引用回帖:
4楼: Originally posted by jamy1989 at 2014-05-10 14:03:06
我做了蛋白浓度梯度的EMSA,在蛋白浓度低的时候是会出现探针弥散,蛋白浓度高时探针就不会弥散,上面这个图是用高浓度蛋白做的,3号条带只是变淡了,能算弥散吗?...

probe弥散反应了一种probe-protein的中间状态,还是那么多probe,但是分布在很大范围之后,就会显得很弱。EMSA做的就是protein-polynucleotide的比例关系,你蛋白浓度低的时候能出现弥散,提高了蛋白就好了,等于提高了蛋白:核酸比例,竞争的时候加入竞争probe,不就等于降低蛋白:核酸比例么?
5楼2014-05-10 19:03:20
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jamy1989

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-10 19:03:20
probe弥散反应了一种probe-protein的中间状态,还是那么多probe,但是分布在很大范围之后,就会显得很弱。EMSA做的就是protein-polynucleotide的比例关系,你蛋白浓度低的时候能出现弥散,提高了蛋白就好了,等于提 ...

首先,谢谢你,你说的很有道理!你比较一下我那2,3,4号条带,它的宽细都差不多,应该不算弥散吧,蛋白浓度低时,条带就很宽,明显很散的样子,但这个好像就是亮度变淡了,会不会是加入竞争性DNA后,有一部分标记的DNA没有进入凝胶呢?
qwdr
6楼2014-05-11 08:27:52
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
jamy1989: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-05-11 21:28:33
引用回帖:
6楼: Originally posted by jamy1989 at 2014-05-11 08:27:52
首先,谢谢你,你说的很有道理!你比较一下我那2,3,4号条带,它的宽细都差不多,应该不算弥散吧,蛋白浓度低时,条带就很宽,明显很散的样子,但这个好像就是亮度变淡了,会不会是加入竞争性DNA后,有一部分标记的 ...

我遇到的弥散,并不是说是宽度的变化,而是分布在泳道上下很大的范围,比如从free-probe到shift之间,因为在这种蛋白:核酸比例下,形成了很多中间状态的complex,分布在泳道大小不同的位置,导致信号显得丢失了。
至于是不是没有入孔,或者是不是这一管probe压根就给少了,这更多的是操作上面的问题,空说无凭了,你要自己control,实验需要重复。
7楼2014-05-11 14:18:16
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jamy1989

木虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-11 14:18:16
我遇到的弥散,并不是说是宽度的变化,而是分布在泳道上下很大的范围,比如从free-probe到shift之间,因为在这种蛋白:核酸比例下,形成了很多中间状态的complex,分布在泳道大小不同的位置,导致信号显得丢失了。 ...

你好,之前发了几个重复的帖子,总是没看到图片,后来发现是电脑的问题。还是请你看下刚发的帖子“EMSA竞争性试验和蛋白梯度试验”。上面你提到的,蛋白核酸分布在泳道大小不同的位置,导致信号显得丢失了,这个丢失是指DNA扩散到胶的不同位置,浓度太低,以至于显色时没显出来吗?还有没有入孔,我的意思是一部分标记的DNA点到胶孔里,但是跑胶没有进入到凝胶里,以至于转膜时标记的总DNA变少,会不会有这种可能?至于probe就给少了应该不可能,量的操作应该没什么问题!
qwdr
8楼2014-05-11 21:28:28
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cathy77yy

新虫 (初入文坛)

hello,你的EMSA做成功了吗
9楼2014-10-11 00:22:47
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jamy1989

木虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by cathy77yy at 2014-10-11 00:22:47
hello,你的EMSA做成功了吗

成功了啊!
qwdr
10楼2014-10-11 21:02:11
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