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monster_zeh金虫 (小有名气)
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[求助]
怎么确定一种生物中是否有某种酶 已有1人参与
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一种生物中是否有纤维素酶、溶菌酶、脂肪酶等等。 各位大侠，我是新手，请不吝赐教。 |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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4楼2014-07-09 09:26:16
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【答案】应助回帖
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样品中的特定的酶是否存在的实验检测方法 I.最简单的一种方法：测定样品中有没有纤维素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的生物活性，如果酶的活性没有被抑制的话，也可以同时用有关的特定的酶的特征的红外、可见光、紫外光光谱、原子光谱分析进行测定，尤其是这些酶有一些象NADH、FADH之类有机小分子辅基或辅酶或者含有有金属离子时，后者用原子光谱分析。 但是以上只是证明样品中可能有纤维素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶，有可能存在与它们有同样活性的其他物质，甚至还不一定就是别的同种活性的生物酶。 II。精确的方法（没有查到祥光酶的标准检测试验流程的前提下）：根据纤维素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的相对分子量进行分子筛层析或者其他的纤维素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的标准分离方法，分离出同等分子量的生物大分子，然后测定其生物活性。接着用用有关的特定的酶的特征的红外、可见光、紫外光光谱、原子光谱分析进行测定，尤其是这些酶有一些象NADH、FADH之类有机小分子辅基或辅酶或者含有有金属离子时，后者用原子光谱分析。这样基本上可以知道纤维素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶在样品中是否存在了，现在的有关酶试剂的商品说明一般可能查到常用的酶的检测标准，也可以根据有关常用的酶的检测标准，比如特征光谱、MS、HPLC、SDS PAGE电泳等完成检测。 如果完全查不到有关的酶的检测标准，而且检测要求非常精确的做法，那么做法如下： 1.用HPLC或普通分子筛层析根据目的蛋白质的相对分子量进行分离，也可以根据酶的推荐使用的其他分离方法，比如离子交换层析、亲和层析等分离出目的蛋白质，为了更加精确，一般最好在用非HPLC的情况下应该使用HPLC进行一次完整蛋白质的相对分子量鉴定或者用MS做一次分子量鉴定，同时也是鉴定纯度，还可以用特征光谱、溶解法、SDS PAGE、WB等手段鉴定分离的蛋白质的纯度。一般这一步不要用肽谱分析，因为用了样品就损失了，后面检测还要接着做。MS损失样品很少。这步实验也尽量少用SDS PAGE或WB，因为SDS PAGE回收的蛋白质不一定都能复性，WB的蛋白质则损失了，影响后面的酶活性的测定。 2.酶的生物活性的测定。这一步取目的酶的最适反应条件。酶的生物活性的测定不要放在第一步，因为样品所处环境复杂，很可能目的酶的生活活性被抑制，不要第一步对于样品检测生物活性，发现没有就此放弃。严格一些需要测定目的酶的比活性。 3.对于分离生物大分子对于此种生物大分子进行有限酶水解（通常用胰蛋白酶），可以再对于各个水解片段进行MS测定相对分子量；与此同时，用自动测序仪测定N末端和C末端各测定连续的15个氨基酸左右的氨基酸序列，或者对于此种生物大分子进行有限酶水解（水解酶视酶的相对分子量大小而定，不一定用胰蛋白酶，有必要的话可以用两次不同的水解酶有限水解）后，分别对于两个相邻的水解片段分别用自动测序仪测定序列和用MS测定相对分子量（对于同一次有限水解的每一个蛋白质片段只做一次测定，或者测序或者做MS测定相对分子量），如果这些数据都符合数据库中的与目的酶来源及类型完全相同的酶。 分离时目的产物酶时，一般不要根据纤维素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的相对分子量使用SDS PAGE电泳分离目的蛋白质，因为SDS PAGE回收的蛋白质不一定都能复性；也尽量少用SDS PAGE或WB，WB的蛋白质则损失了，这样下一步就不能用生物活性方法测定是否存在目的酶。 有人可能可能认为：根据纤维素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的相对分子量使用SDS PAGE电泳分离目的蛋白质，虽然SDS PAGE回收的蛋白质不一定都能复性，但是可以用没有限水解后，分别测定相邻水解片段的序列和相对分子量之一（对于同一次有限水解的每一个蛋白质片段只做一次测定，或者测序或者做MS测定相对分子量）。实际上SDS PAGE已经使得蛋白质变性，而复性可能也不是完全，可以用CD和红外傅立叶光谱同时检测，折叠状态即使有生活性也可能不是生理状态的构象，因此有限酶水解可能与天然酶不一样，所以分别测定相邻水解片段的序列和相对分子量之一（对于同一次有限水解的每一个蛋白质片段只做一次测定，或者测序或者做MS测定相对分子量）得到的数据可能与数据实际不符，除非有数据库中的数据就是这样获得的。 4.没有条件做第三步实验，则建议用CD、红外傅立叶光谱、荧光光谱、紫外可见光光谱同时检测第一步分离出的产物的特征光谱，同时结合第二步酶活性测定。这些都是阳性结果之后，再用SDS PAGE电泳或WB检测一次，有条件可同时SDS PAGE电泳和WB，没有条件，至少用一次SDS PAGE电泳。 |
5楼2014-07-09 09:51:13
凌波丽
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6楼2014-07-09 09:54:21
