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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 体外转录求助！！
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 体外转录求助！！ 已有3人参与

文献和产品说明书都说，带T7或SP6启动子的PCR
产物就可以做体外转录，但我试过很多次都失败了，不过我用线性化的质粒为模板是可以的！请帮忙分析下！谢谢！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2014-07-08 04:09:33
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hrjailjg

新虫 (初入文坛)
请问您的模板是怎么获得的？酶切切多少
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2楼2014-11-23 02:44:59
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hrjailjg at 2014-11-23 02:44:59
请问您的模板是怎么获得的？酶切切多少

最好多切点，回收后浓度约1ug/ul.

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-11-23 08:20:39
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
tuodecai: 金币+1, ★有帮助, 谢谢回帖 2015-09-12 23:52:18
肯定要线性化吧，想想，如果不线性化就好像是在一直转啊转啊
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4楼2015-09-12 09:20:01
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 沉默的独角兽 at 2015-09-12 09:20:01
肯定要线性化吧，想想，如果不线性化就好像是在一直转啊转啊

其实我是想问为用PCR获得的DNA做体外转录怎么转不成功，理论上线性化质粒可以，PCR片段也应该可以的。咱帖子写得不太清楚，让你误解了我的问题。
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5楼2015-09-12 23:56:49
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by tuodecai at 2015-09-12 23:56:49
其实我是想问为用PCR获得的DNA做体外转录怎么转不成功，理论上线性化质粒可以，PCR片段也应该可以的。咱帖子写得不太清楚，让你误解了我的问题。...

按道理来说是可以的，你回收后的浓度怎么确定的？我查查资料
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6楼2015-09-13 11:38:16
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by tuodecai at 2015-09-12 23:56:49
其实我是想问为用PCR获得的DNA做体外转录怎么转不成功，理论上线性化质粒可以，PCR片段也应该可以的。咱帖子写得不太清楚，让你误解了我的问题。...

PCR获得的片段绝对没有问题，你检测PCR序列，既然你线性化质粒可以做，就不怀疑你体外转录本身有问题了。

模板不需要很多，对浓度更是没有要求，一般而言，我一个转录体系质粒（~5000 bp）就给500 ng，如果换成DNA片段，那就很少很少了。
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7楼2015-09-13 13:59:17
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惘人一月刀

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

PCR产物楼主表征过吗，确定序列是对的吗？如果序列对的话，转录的时间是多久？我之前也是PCR产物转录不出来，但是把转录时间延长到4h，就成功了。
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8楼2019-01-25 15:43:13
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