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海棠依旧磊

新虫 (初入文坛)

[求助] 从转录组中找到感兴趣的基因进行克隆表达 已有1人参与

想从转录组数据中找到感兴趣的基因进行克隆表达，找到基因后在NCBI上BLAST发现和同源物种的基因相似性很高（80%左右），片段长度也差不多（2000bp左右），接下来想分析该基因的结构，进行各组织的定量qtPCR等实验，请问下还需要重新扩增该基因吗？？？还是直接使用转录组的序列设计定量引物呢？？
          刚接触这方面的知识，都不太懂。。。个人感觉需要重新扩增，因为他是拼接起来的，可能他的长度和我重新扩增的长度会有较大的区别。？但是问了一些师兄师姐，说转录组的数据相对来言比较准确，不需要扩增可以直接使用。但是到时写文章的时候该怎么说明基因的来源呢？？？我看到有些SCI中会说先测序，后建立BAC文库，然后在使用基因进行分析。？不太懂。。。。
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1楼 2014-07-07 19:08:27
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llyman

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 大爷给跪了 at 2014-07-15 13:41:01
你说的不太清楚，我想大概分两种情况：
1：用提取dna重新扩增，长度比测序的长；2：用提取的rna反转的cdna重新扩增比测序的片段长；
如果是1，那是正常的，转录组的测的就是rna反转的cdna，测序片段是不含内含子的 ...

请问我有无参考基因组的转录组测序结果，找到一些unigene，但是用他们做拟南芥的比对时，总是没有结果，请教这样的问题该如何解决
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4楼2014-07-17 11:00:56
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海棠依旧磊

新虫 (初入文坛)
希望各位虫友不吝回答啊
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2楼2014-07-14 18:03:01
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大爷给跪了

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
海棠依旧磊(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-15 18:54:06
海棠依旧磊: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 现在自己提rna反转cdna后，根据转录组序列设计引物重新扩增，由于ORF有1800bp左右，所以设计了几对1200-2000bp的引物，可是都没有跑出目的条带啊。。。不知道是什么原因？？？所以准备分段进行设计引物再看看。。。 2014-07-19 19:17:21
你说的不太清楚，我想大概分两种情况：
1：用提取dna重新扩增，长度比测序的长；2：用提取的rna反转的cdna重新扩增比测序的片段长；
如果是1，那是正常的，转录组的测的就是rna反转的cdna，测序片段是不含内含子的，这就是为什么你重新扩增比你的测序片段长。
如果是2，也是正常的，因为测序结果还需要进行拼接，在我们的测序得到的unigene中，有gap的，这就导致你重新扩增的结果和测序的结果可能不一致。
最好自己提rna反转cdna后，自己重新扩增，这样就是最准的。但大体上不会和转录组结果有什么出入。
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3楼2014-07-15 13:41:01
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大爷给跪了

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by llyman at 2014-07-17 11:00:56
请问我有无参考基因组的转录组测序结果，找到一些unigene，但是用他们做拟南芥的比对时，总是没有结果，请教这样的问题该如何解决...

1：比对参数进行改动，设的太高，肯定啥也没有。
2：如果不行，重新拼接数据一次。如果拼接的不好，你的unigene不可靠，也没用。
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5楼2014-07-17 13:55:01
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