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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白浓缩，质谱
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)

[求助] 蛋白浓缩，质谱 已有3人参与

打算做某个蛋白的质谱。蛋白纯化后，浓度太低，western可以检测，可是无法考染或者银染看是否纯。请教，如何保持蛋白活性的前提下将目前约4ml的蛋白溶液浓缩至约100微升(用PEG20000已经初步浓缩)。另外，做质谱的话银染考染都可以吧，样品制备有什么要求。跪求大虾指点。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2014-06-22 14:41:32
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-06-23 08:24:38
用超滤的方法应该没问题，买个超滤管也就100快的样子
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爱拼才会赢
2楼2014-06-22 16:40:33
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by anyaxiong at 2014-06-22 16:40:33
用超滤的方法应该没问题，买个超滤管也就100快的样子

可以控制得到的量吗，一个管子针对同一种样品可以反复使用吗

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-06-23 10:22:05
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馒头爱生物

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白浓缩用3k离心管就可以，时间有点长的话，注意加蛋白酶抑制剂防止降解。
打质谱的话银染考染都可以，不跑胶提供蛋白溶液也可以，但是要提供溶液的成分，方便别人判断应该帮你怎么处理蛋白，因为溶液里很多成分对质谱有影响，要先处理再进行。
质谱的灵敏度特别高，无论做什么处理，请一定要带口罩和手套，有条件的话带帽子，否则你会在自己的质谱检测报告中看到很多keratin角蛋白的。
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4楼2014-06-23 15:42:52
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaoyu0127 at 2014-06-23 10:22:05
可以控制得到的量吗，一个管子针对同一种样品可以反复使用吗
...

量可控，调节离心时间和转速，只要处理的好，超滤管可以重复使用的，网上资料很多的，可以查找下其使用方法，祝好
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爱拼才会赢
5楼2014-06-23 19:05:52
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 馒头爱生物 at 2014-06-23 15:42:52
蛋白浓缩用3k离心管就可以，时间有点长的话，注意加蛋白酶抑制剂防止降解。
打质谱的话银染考染都可以，不跑胶提供蛋白溶液也可以，但是要提供溶液的成分，方便别人判断应该帮你怎么处理蛋白，因为溶液里很多成分对 ...

看了一下质谱相关帖子，提到银染与质谱不兼容，不是您是否用过银染打质谱的经历
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6楼2014-06-24 17:16:44
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 馒头爱生物 at 2014-06-23 15:42:52
蛋白浓缩用3k离心管就可以，时间有点长的话，注意加蛋白酶抑制剂防止降解。
打质谱的话银染考染都可以，不跑胶提供蛋白溶液也可以，但是要提供溶液的成分，方便别人判断应该帮你怎么处理蛋白，因为溶液里很多成分对 ...

最近我也是在细胞裂解液中纯化蛋白，有时候要纯化一个星期，就只是在细胞裂解时加过蛋白酶抑制剂（包括碘乙酰胺，PMSF,抑肽酶）。一直犹豫要不要补加抑制剂，想请教一下，我纯化过程中该以何种比例和频率补加抑制剂，抑制剂加多了会不会有副作用，望指教
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7楼2014-06-24 17:29:26
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馒头爱生物

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaoyu0127 at 2014-06-24 17:16:44
看了一下质谱相关帖子，提到银染与质谱不兼容，不是您是否用过银染打质谱的经历...

我就是专门做质谱的，不管什么胶送过来，都要进行处理的。
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8楼2014-06-25 14:52:27
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 馒头爱生物 at 2014-06-25 14:52:27
我就是专门做质谱的，不管什么胶送过来，都要进行处理的。...

您的意思是银染也可以做质谱？
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9楼2014-06-25 20:45:19
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by anyaxiong at 2014-06-22 16:40:33
用超滤的方法应该没问题，买个超滤管也就100快的样子

第一天用抗原抗体亲和层析，纯化得到的浓度虽然不高，但是western-blot能检测到。接下来反复过柱子，大概一个星期，将得到的蛋白溶液透析浓缩，可是western竟然检测不到了。很奇怪，难道是蛋白浓度低且在4度放了一个星期，蛋白降解了。浓缩条件是聚乙二醇20000，透析是4度PBS,个人认为也不会有问题。除了蛋白裂解液中的蛋白酶抑制剂，纯化的一个星期中都没有补加，不知大家如何补加了，是否对我的降解也有影响，疑惑，求指点。
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10楼2014-06-25 21:42:07
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