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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)

[求助] 蛋白浓缩,质谱 已有3人参与

打算做某个蛋白的质谱。蛋白纯化后,浓度太低,western可以检测,可是无法考染或者银染看是否纯。请教,如何保持蛋白活性的前提下将目前约4ml的蛋白溶液浓缩至约100微升(用PEG20000已经初步浓缩)。另外,做质谱的话银染考染都可以吧,样品制备有什么要求。跪求大虾指点。

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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by anyaxiong at 2014-06-22 16:40:33
用超滤的方法应该没问题,买个超滤管也就100快的样子

第一天用抗原抗体亲和层析,纯化得到的浓度虽然不高,但是western-blot能检测到。接下来反复过柱子,大概一个星期,将得到的蛋白溶液透析浓缩,可是western竟然检测不到了。很奇怪,难道是蛋白浓度低且在4度放了一个星期,蛋白降解了。浓缩条件是聚乙二醇20000,透析是4度PBS,个人认为也不会有问题。除了蛋白裂解液中的蛋白酶抑制剂,纯化的一个星期中都没有补加,不知大家如何补加了,是否对我的降解也有影响,疑惑,求指点。
10楼2014-06-25 21:42:07
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-06-23 08:24:38
用超滤的方法应该没问题,买个超滤管也就100快的样子
爱拼才会赢
2楼2014-06-22 16:40:33
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by anyaxiong at 2014-06-22 16:40:33
用超滤的方法应该没问题,买个超滤管也就100快的样子

可以控制得到的量吗,一个管子针对同一种样品可以反复使用吗

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2014-06-23 10:22:05
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馒头爱生物

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
蛋白浓缩用3k离心管就可以,时间有点长的话,注意加蛋白酶抑制剂防止降解。
打质谱的话银染考染都可以,不跑胶提供蛋白溶液也可以,但是要提供溶液的成分,方便别人判断应该帮你怎么处理蛋白,因为溶液里很多成分对质谱有影响,要先处理再进行。
质谱的灵敏度特别高,无论做什么处理,请一定要带口罩和手套,有条件的话带帽子,否则你会在自己的质谱检测报告中看到很多keratin角蛋白的。
4楼2014-06-23 15:42:52
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