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目的片段加上GFP标签 已有2人参与
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| 贵大侠： 目前在构建融合蛋白，clta +GFP,用的载体pEGFP-n2,双酶切位点为Ecor1和kpn1，双酶切之后，回收产物没有问题，可是一直连不上，转化有单克隆，可是菌液pcr一直没有结果，没有任何条带，急啊！求指导~ |
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sky-飞翔2楼2014-07-28 11:04:49
wopopwz123
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gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 16:25:56
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 16:25:56
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一般这样的问题，有一下几个情况： 第一，你是用PCR产物直接酶切的？还是扩增片段链接T载体以后送测序以后再酶切的？ 如果你是PCR产物直接做酶切的，可能切不下来或是酶切不完全，你连接以后转化到感受态中，可能会出现载体自连接。如果你是从载体上酶切的，基本上没有这样的问题。 第二，你说你酶切能切下来，但是PCR检测没有条带？ 你的退火温度是多少？ 我建议你用60度试试，我做融合表达的时候，GFP的温度就是60度。 |
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3楼2014-07-28 13:25:22
4楼2014-07-28 16:03:23
5楼2014-07-28 16:05:21
wopopwz123
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6楼2014-07-28 20:43:36
7楼2014-07-29 17:04:54