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xueyutianj

新虫 (小有名气)

[求助] 求助荧光纳米颗粒标记免疫分析实验 谢谢

各位大牛好，新手求助。
最近在做一个纳米颗粒偶联的荧光二抗，纳米颗粒上标记荧光分子是FITC, 想用酶联免疫吸附的方法验证这个荧光二抗的性能及检测下限，用的是全黑的荧光酶标板，问题是，每次做完直接用紫外灯照的话一点荧光都看不见，我们实验室也没有能测96孔板荧光的设备，所以没扫过荧光，只是拿紫外灯照了看，不过啥荧光也看不出来，我想拿到类似于文献中的图（见下）可不知道文献里的图是用什么设备或者什么方法做出来的，这个也许太基本了，文献里也没有详细的这方面过程说明。求有经验的指导。新手完全不会，实验室是做化学的，也完全没这方面基础。
求助荧光纳米颗粒标记免疫分析实验 谢谢
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蛋白质生物学实验经验 细胞生物学实验经验 【分子生物】EPI帖 纳米生物学

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1楼 2013-06-28 12:57:51
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myprayer

专家顾问 (著名写手)

优秀版主

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★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流心得，经验 2013-06-29 14:01:22
1949stone: MolEPI+1, 膜拜下 2013-07-01 07:52:26
这本书可能对楼主有用，关于荧光技术介绍的很全面，特别适合跨专业多学科交叉的新手学习，啃读。在论坛里面能直接下载到到的
下载链接为
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=1923202

书名：细胞生物学荧光技术原理和应用
作者：刘爱平
出版社：中国科学技术大学出版社，2007
页数：320页
前言
第一部分 基本知识
第一章 光的基本知识
第二章 荧光的基本知识
第一节 荧光的发光原理
第二节 荧光色素的性质
第三节 组织细胞的自发荧光与继发荧光
第四节 荧光的淬灭及抗淬灭
第五节 荧光光谱交叉干扰及消除
第三章 荧光染料(色素)的早期应用和发展史
第四章 常用的荧光染料(探针)
第一节 细胞器荧光探针
第二节 细胞骨架荧光探针
第三节 研究钙调节及活性的荧光探针
第四节 核酸荧光探针
第五节 其他荧光探针
第五章 活体荧光材料——绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物
第六章 最新型荧光材料——量子点
第二部分 荧光色素(探针)在细胞生物学中的应用
第七章 荧光技术在细胞生物学中的应用
第一节 细胸凋亡及其基本通路
第二节 荧光显微镜对细胞凋亡的形态学观察
第三节 凋亡调控分子的荧光标记在细胞凋亡研究中的应用
第四节 其他荧光技术在细胞凋亡研究中的应用
第八章 流式细胞技术在细胞生物学中的应用
第一节 检测细胞的特征
第二节 检测细胞的增殖和凋亡状态
第三节 定量检测可溶性蛋白质(CBA技术)
第四节 纯化特定的细胞
第九章 荧光在细胞骨架研究中的应用
第一节 荧光技术在微丝骨架研究中的应用
……
第十章 荧光原位杂交
第十一章 荧光在GER2/ErbB2/p185研究中的应用
第十二章 绿色荧光
第十三章 免疫荧光细胞化学技术
第三部分 常用荧光检测仪器
第十四章 生物荧光显微镜
第十五章 激光扫描共聚焦显微镜
第十六章 活细胞显微成像技术
第十七章 活体体内荧光成像技术
第十八章 流式细胞质仪
第十九章 荧光定量PCR仪
第二十章 荧光分光光度计
第二十一章 激光扫描成像仪
附录 免疫细胞化学常用试剂及其配制方法
求助荧光纳米颗粒标记免疫分析实验 谢谢-1
细胞生物学荧光技术原理和应用.png



[ Last edited by myprayer on 2013-6-29 at 12:41 ]
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3楼2013-06-29 12:38:05
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-29 23:29:24
1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-07-01 07:52:56
引用回帖:
5楼: Originally posted by xueyutianj at 2013-06-29 20:07:50
我的纳米颗粒就是二氧化硅纳米小球啊，我表面改性后接上了FITC和识别二抗，实验目的就是看看这种接了一堆FITC的小球能不能起到荧光放大作用，提高检测下限。但我对生物实验一窍不通，还恳请大牛指导...

我不是大牛，因为不知道你的实验目的，所以猜不出你的二氧化硅纳米小球在实验当作什么用？
我下面先解释一下荧光量子点技术-----以CdSe荧光量子点为例和免疫胶体金技术的基本原理，以供参考。

1.荧光量子点技术-----以CdSe荧光量子点为例：任何量子点的核心都是有过度钛金属构成，其都可以在特定波长的外界光源激发下发生荧光。CdSe是目前量子点最常用的化合物。下面讲一下荧光量子点的构成和作用原理。
（1）CdSe荧光量子点核心：CdSe是荧光量子点的核心（CdSe核心颗粒外包上ZnS层，ZnS层外包上巯基乙酸，巯基乙酸的巯基与ZnS的S形成共价键链接，巯基乙酸的羧基游离。CdSe荧光量子点核心就是用以激发荧光的标记物，荧光直接有CdSe受到激发后产生。CdSe荧光量子点核心本身可以激发荧光，而且其大小不同荧光的波长也不同。
（2）CdSe荧光量子点核心之外的连接的功能蛋白质：
a.可分为识别细胞中的特定的生物大分子（多数为特定的蛋白质）的抗体或者配体或者受体蛋白质，如果说要识别的细胞内的生物大分子是某种蛋白质，一般的识别蛋白往往用该墓白哦蛋白质的单克隆抗体；
b.把荧光量子点引导穿过细胞膜的向导蛋白质，一般是细胞能够自动内吞的蛋白质，比如：转铁蛋白，入核的话还要加上一些入核的氨基酸序列。早期的荧光量子点核心之外的连接的功能蛋白质没有把荧光量子点引导穿过细胞膜的向导蛋白质，那就要用显微注射方法，将量子点导入细胞，工作量就相当大了。
（3）CdSe荧光量子点核心与其核心之外的连接的功能蛋白质之间的化学连接方式：：CdSe是荧光量子点的核心（CdSe核心颗粒外包上ZnS层，ZnS层外包上巯基乙酸，巯基乙酸的巯基与ZnS的S形成共价键链接，巯基乙酸的羧基游离。蛋白质有氨基酸聚合而成，每一个蛋白质至少有一个游离的氨基和一个游离的羧基（有修饰的情况下，一般不不会把N和C末端都修饰了，而会在中间部位修饰Lys/Arg氨基酸残基的游离的侧链氨基与Asp/Glu氨基酸残基的游离的侧链羧基。如果真的把所有的游离的氨基与羧基都修饰了，这样的情况很少见，那么就用修饰分子的游离出活跃的基团，比如羟基，巯基等作为连接位点），那么一般的蛋白质的氨基就可以用碳二亚胺（比如： EDC）在室温下催化讲两者的一个氨基和一个羧基脱水缩合称为一个酰胺键，那么CdSe荧光量子点核心与其核心之外的连接的功能蛋白质之间就通过酰胺键连接到一起。
（4）CdSe荧光量子点的作用原理：实际上进入细胞候就是靠CdSe荧光量子点的单克隆抗体部分识别有关的蛋白质------也就是此单抗的抗原，再用外界光源照射细胞，CdSe荧光量子点的CdSe受激辐射，就暴露了自己在细胞中的位置，同时也就暴露了其上的单抗的抗原（目的蛋白质）的位置。观测荧光要用荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜，测定荧光强弱要用荧光光度计。

2.免疫胶体金技术：胶体金（纳米金颗粒）本身可以充当电镜下的标志物。
因为胶体金颗粒能够用电子显微镜直接观察到，所以把胶体金报上有机膜之类接上抗体和内吞蛋白质，原理与CdSe荧光量子点一样，只是显示标签变成了胶体金，有时候胶体金还要与银共同作用，以便加强在电子显微镜下的可观测性。

我因为不知道你的实验目的，所以猜不出你的二氧化硅纳米小球在实验当作什么用？能够解释你的实验目的。因为你写到：“我的纳米颗粒就是二氧化硅纳米小球啊，我表面改性后接上了FITC和识别二抗，实验目的就是看看这种接了一堆FITC的小球能不能起到荧光放大作用，提高检测下限。”可是FITC本身就是荧光小分子，所以从激发荧光的角度讲：用不着在连接到二氧化硅纳米小球上，抗体的作用我能够理解，二氧化硅纳米小球的作用我不理解，因为你可以直接把FITC接到抗体上，然后用显微注射或者用再接上一段入胞的蛋白质就可以把抗体-FITC送入细胞。二氧化硅纳米小球是用于离心沉淀？还是链接物体？我不懂。
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6楼2013-06-29 22:29:25
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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xueyutianj(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-29 12:43:29
不同的荧光基团的激发波长并不相同。你是做小分子荧光标记，还是做荧光量子点？你应该不是做荧光量子点吧，因为荧光量子点核心的过渡态尽数本身就可以激发荧光，不用再偶联上荧光分子FITC。当然两者的纳米颗粒（假设你的纳米颗粒也是金属颗粒）的共价链接的原理差不多。

楼主能不能说说你的纳米颗粒是什么？是纳米金吗？你的实验目的是什么？不然我们没有办法讨论下去。
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2楼2013-06-29 00:14:43
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凌波丽

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3楼: Originally posted by myprayer at 2013-06-29 12:38:05
这本书可能对楼主有用，关于荧光技术介绍的很全面，特别适合跨专业多学科交叉的新手学习，啃读。在论坛里面能直接下载到到的
下载链接为
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=1923202

书名：细胞生物学荧 ...

这本书不错！我先去下载来好好学习一下。
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4楼2013-06-29 12:45:17
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xueyutianj

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引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-29 00:14:43
不同的荧光基团的激发波长并不相同。你是做小分子荧光标记，还是做荧光量子点？你应该不是做荧光量子点吧，因为荧光量子点核心的过渡态尽数本身就可以激发荧光，不用再偶联上荧光分子FITC。当然两者的纳米颗粒（假设 ...

我的纳米颗粒就是二氧化硅纳米小球啊，我表面改性后接上了FITC和识别二抗，实验目的就是看看这种接了一堆FITC的小球能不能起到荧光放大作用，提高检测下限。但我对生物实验一窍不通，还恳请大牛指导
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5楼2013-06-29 20:07:50
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xueyutianj

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-29 22:29:25
我不是大牛，因为不知道你的实验目的，所以猜不出你的二氧化硅纳米小球在实验当作什么用？
我下面先解释一下荧光量子点技术-----以CdSe荧光量子点为例和免疫胶体金技术的基本原理，以供参考。

1.荧光量子点技术 ...

纳米小球的作用在于 单个小球上复合了几百个荧光分子 超级亮，比单个荧光分子接到抗体上荧光强上百倍的。
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7楼2013-06-30 21:49:58
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 15:02:45
引用回帖:
7楼: Originally posted by xueyutianj at 2013-06-30 21:49:58
纳米小球的作用在于 单个小球上复合了几百个荧光分子 超级亮，比单个荧光分子接到抗体上荧光强上百倍的。...

我已经查到了材料。
现在一般用的纳米小球使用纳米金或者纳米银颗粒。，其暴露于白色光源时可以在不同的波长处释放能量，即所谓的resonance light scattering.这在蛋白质芯片中也是一张常用的标记手段。使用纳米金或者纳米银颗粒作为标记物，单个金或者银的纳米粒子可以相当于500，000个荧光基团的激发光强度；金或者银的纳米粒子之间不会发生漂白或者猝灭；金或者银的纳米粒子可以在激光共聚焦显微镜下或者普通显微镜暗场下直接观测点到，粒子直径一般不小于40纳米，不大于80纳米；金或者银的纳米粒子可以包被抗体，受体，配体或者DNA探针。
楼主用硅纳米粒子也可以，但是荧光增强首先是纳米粒子本身的作用，而不是因为纳米粒子链接了众多的荧光分子，后者最多只能线性增强荧光。
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8楼2013-07-05 11:52:06
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凌波丽

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现在一般用的纳米小球使用纳米金或者纳米银颗粒，其暴露于白色光源时可以在不同的波长处释放能量，即所谓的resonance light scattering.这在蛋白质芯片中也是一张常用的标记手段。

但是其他纳米球可不是用白光就能激发出荧光。
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9楼2013-07-05 11:54:12
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