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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的片段加上GFP标签
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sky-飞翔

新虫 (小有名气)

[求助] 目的片段加上GFP标签 已有2人参与

贵大侠： 目前在构建融合蛋白，clta +GFP,用的载体pEGFP-n2,双酶切位点为Ecor1和kpn1，双酶切之后，回收产物没有问题，可是一直连不上，转化有单克隆，可是菌液pcr一直没有结果，没有任何条带，急啊！求指导~
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1楼 2014-06-14 11:53:12
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sky-飞翔

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 精分的兔子 at 2014-07-28 11:04:49
如果是我做我会多试几个比例的连接体系 如果回收的条带很亮的话 减少片段体积 增加载体比例

回收条带不是很亮；我做连接片段：载体约为7:1.
尝试多次，连接效率低，但是有阳性克隆了，可以继续了。谢谢！
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4楼2014-07-28 16:03:23
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精分的兔子

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
sky-飞翔(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-28 11:11:33
如果是我做我会多试几个比例的连接体系 如果回收的条带很亮的话 减少片段体积 增加载体比例
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sky-飞翔
2楼2014-07-28 11:04:49
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wopopwz123

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 16:25:56
一般这样的问题，有一下几个情况：
第一，你是用PCR产物直接酶切的？还是扩增片段链接T载体以后送测序以后再酶切的？ 如果你是PCR产物直接做酶切的，可能切不下来或是酶切不完全，你连接以后转化到感受态中，可能会出现载体自连接。如果你是从载体上酶切的，基本上没有这样的问题。
第二，你说你酶切能切下来，但是PCR检测没有条带？ 你的退火温度是多少？ 我建议你用60度试试，我做融合表达的时候，GFP的温度就是60度。
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sky-飞翔
3楼2014-07-28 13:25:22
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sky-飞翔

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by wopopwz123 at 2014-07-28 13:25:22
一般这样的问题，有一下几个情况：
第一，你是用PCR产物直接酶切的？还是扩增片段链接T载体以后送测序以后再酶切的？ 如果你是PCR产物直接做酶切的，可能切不下来或是酶切不完全，你连接以后转化到感受态中，可能会 ...

之前做，都是pcr产物直接酶切，木问题。这次，将pcr产物提纯之后，酶切，效果好很多。目前，已经连接成功。我用退火温度是61度，可行。谢谢！
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5楼2014-07-28 16:05:21
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