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小纸鹤_夏

新虫 (小有名气)

[求助] 合成一段DNA过程中引入突变 已有2人参与

刚刚设计一个实验计划:
1、目的是想对一段基因引入突变,但是突变位点靠近末端:5‘端84bp处及3’端45bp处,因而很难通过重叠延伸PCR方法通过引物来引入突变。
2、因而计划将两端的分别100bp通过人工合成的方法获得,并在合成过程中在相应位置引入NST突变库,并在100bp片段的两端加上酶切位点。
3、将合成的DNA片段及野生型整个DNA片段通过酶切酶连整合在一起(因为全合成费用太高)。

以上的计划有哪位前辈做过吗?希望各位不吝赐教,谢谢大家!
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-06-10 00:10:33
小纸鹤_夏: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-11-07 21:10:28
长片段引物PCR吧。
我用100多bp的引物做过PCR,没有问题的。
2楼2014-06-09 22:11:35
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小纸鹤_夏

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by BioChen at 2014-06-09 22:11:35
长片段引物PCR吧。
我用100多bp的引物做过PCR,没有问题的。

谢谢指导!
另外,我还想问问,在设计长引物的过程中有哪些需要注意的呢,我所知道的是长引物不容易PCR成功,谢谢!
3楼2014-06-10 09:05:21
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BioChen

银虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小纸鹤_夏 at 2014-06-10 09:05:21
谢谢指导!
另外,我还想问问,在设计长引物的过程中有哪些需要注意的呢,我所知道的是长引物不容易PCR成功,谢谢!...

按你需要设计长引物,无视所谓的引物设计原则。
如果长引物从cDNA扩增不出来,或者杂带很多。你先用短引物把目的片段扩增出来,然后用长引物PCR
4楼2014-06-10 10:30:12
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你两端那100bp的序列中挨着你基因的部分都得加酶切位点不影响你基因的功能吗~?
大家相互帮助哈
5楼2014-06-10 12:58:19
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小纸鹤_夏

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-10 12:58:19
你两端那100bp的序列中挨着你基因的部分都得加酶切位点不影响你基因的功能吗~?

原计划中想合成的DNA是在整个基因中有酶切位点的地方截取的,所以,不用再额外加酶切位点
6楼2014-06-10 14:33:39
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小纸鹤_夏

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by BioChen at 2014-06-10 10:30:12
按你需要设计长引物,无视所谓的引物设计原则。
如果长引物从cDNA扩增不出来,或者杂带很多。你先用短引物把目的片段扩增出来,然后用长引物PCR...

我的目的基因不是cDNA,是很明确的DNA序列,谢谢您的建议,如果没有更好的方案,我就尝试一下长引物PCR
7楼2014-06-10 14:35:07
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