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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 合成一段DNA过程中引入突变
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小纸鹤_夏

新虫 (小有名气)

[求助] 合成一段DNA过程中引入突变 已有2人参与

刚刚设计一个实验计划：
1、目的是想对一段基因引入突变，但是突变位点靠近末端：5‘端84bp处及3’端45bp处，因而很难通过重叠延伸PCR方法通过引物来引入突变。
2、因而计划将两端的分别100bp通过人工合成的方法获得，并在合成过程中在相应位置引入NST突变库，并在100bp片段的两端加上酶切位点。
3、将合成的DNA片段及野生型整个DNA片段通过酶切酶连整合在一起（因为全合成费用太高）。

以上的计划有哪位前辈做过吗？希望各位不吝赐教，谢谢大家！
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1楼 2014-06-09 19:45:02
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-10 00:10:33
小纸鹤_夏: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-11-07 21:10:28
长片段引物PCR吧。
我用100多bp的引物做过PCR，没有问题的。
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2楼2014-06-09 22:11:35
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小纸鹤_夏

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BioChen at 2014-06-09 22:11:35
长片段引物PCR吧。
我用100多bp的引物做过PCR，没有问题的。

谢谢指导！
另外，我还想问问，在设计长引物的过程中有哪些需要注意的呢，我所知道的是长引物不容易PCR成功，谢谢！
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3楼2014-06-10 09:05:21
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BioChen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小纸鹤_夏 at 2014-06-10 09:05:21
谢谢指导！
另外，我还想问问，在设计长引物的过程中有哪些需要注意的呢，我所知道的是长引物不容易PCR成功，谢谢！...

按你需要设计长引物，无视所谓的引物设计原则。
如果长引物从cDNA扩增不出来，或者杂带很多。你先用短引物把目的片段扩增出来，然后用长引物PCR
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4楼2014-06-10 10:30:12
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你两端那100bp的序列中挨着你基因的部分都得加酶切位点不影响你基因的功能吗~？
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大家相互帮助哈
5楼2014-06-10 12:58:19
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小纸鹤_夏

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-10 12:58:19
你两端那100bp的序列中挨着你基因的部分都得加酶切位点不影响你基因的功能吗~？

原计划中想合成的DNA是在整个基因中有酶切位点的地方截取的，所以，不用再额外加酶切位点
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6楼2014-06-10 14:33:39
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小纸鹤_夏

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by BioChen at 2014-06-10 10:30:12
按你需要设计长引物，无视所谓的引物设计原则。
如果长引物从cDNA扩增不出来，或者杂带很多。你先用短引物把目的片段扩增出来，然后用长引物PCR...

我的目的基因不是cDNA，是很明确的DNA序列，谢谢您的建议，如果没有更好的方案，我就尝试一下长引物PCR
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7楼2014-06-10 14:35:07
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