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hexianwei123新虫 (初入文坛)
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放线菌DNA提取 已有1人参与
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求各位大侠帮忙看一下我的放线菌DNA提取方法哪里需要改进，每次都提不出DNA？ 步骤： 1. 取出培养2-3天的液体菌，静置； 2. 用无菌水离心洗绦2次，TE溶液洗绦一次； 3. 加入10mlTE溶液，匀浆器匀浆，悬浮，加入200ul的溶菌酶（25mg/ml）； 4. 37℃放置至溶液发粘，不时轻轻颠倒（7-8小时）； 5. 加入20%SDS（蛋白质变性剂，使细胞崩解）溶液至终浓度为2%； 6. 55℃烘箱放置1小时，不时轻轻颠倒，至溶液粘稠透明； 7. 加入等溶液体积TRis平衡酚，上下轻轻颠倒，室温放置10min，12000r，10min,4℃离心，吸取上层水相放入另外一个干净50ml离心管中。重复此步骤(可重复使用分离下层的酚)，直至溶液中间层没有沉淀出现。 8. 加入等体积氯仿(指变性的DNA)，上下轻轻颠倒，室温放置10分钟，12000r,10min,4℃,离心。吸取上清液放入一个干净的EP管中。 9. 加入1/10上清液体积的醋酸钠,再加入2倍体积的无水乙醇。如有絮状物，勾出； 10. 冰上放置20min,14000r,10min,4℃,离心； 11. 倒掉上清液，加入无水乙醇沉淀DNA，14000r,5min,4℃,轻轻倒掉上清液，在室温放置，使EP管中水风干，根据DNA的量加入无菌水使DNA溶解。（跑电泳） 有两次提取出来的是RNA,没有DNA，不知道怎么回事？请各位老师指点一下！谢谢！！ |
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这么复杂？我们实验室通用方法：TE+溶菌酶，37°摇床过夜——20%SDS+PK——60°水浴1小时左右——后门就是抽提了。具体参见导师主编的教材 徐丽华，李文均，姜成林 放线菌系统学 |
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hexianwei1232楼2014-06-05 12:48:43
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