应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于原核表达肠激酶切，做了两次了都没切开。
51/1返回列表
查看: 1488  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

a1059277

金虫 (初入文坛)

[求助] 关于原核表达肠激酶切，做了两次了都没切开。 已有2人参与

最近在用PET30a表达了一个蛋白，到了肠激酶酶切这一步卡住了，切了两次了都没切开。

目的蛋白50KDa左右，切除后应该是43kDa左右（His标签大概7kDa），但是蛋白电泳图跟对照和marker都一致在50。

我的蛋白液100ml左右，用了两次100ul的肠激酶了（总共200ul），酶切条件是22°，16h。

各位帮忙分析下原因，谢谢咯。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-05-23 21:43:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
常规SDS-PAGE分析不是很直观，建议楼主做一个WB检测下，切前和切后作对照
赞一下 回复此楼
爱拼才会赢
4楼2014-05-26 11:14:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答

rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-26 09:28:01
一个可能肠激酶失活，要做个正对照
二可能你纯化的蛋白里面有东西影响了酶切，建议将蛋白透析干净后再切
赞一下 回复此楼
2楼2014-05-26 09:06:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

a1059277

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by rodickholm at 2014-05-26 09:06:18
一个可能肠激酶失活，要做个正对照
二可能你纯化的蛋白里面有东西影响了酶切，建议将蛋白透析干净后再切

我是用的梯度透析，最后一步透析液是 20mM Tris，200mM nacl
赞一下 回复此楼
3楼2014-05-26 11:05:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

a1059277

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by anyaxiong at 2014-05-26 11:14:35
常规SDS-PAGE分析不是很直观，建议楼主做一个WB检测下，切前和切后作对照

按理说7Kda的大小应该可以看出来的，酶切后一点差别都没有，别人酶切的都很好。
赞一下 回复此楼
5楼2014-05-26 14:45:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭