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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于原核表达肠激酶切，做了两次了都没切开。
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a1059277

金虫 (初入文坛)

[求助] 关于原核表达肠激酶切，做了两次了都没切开。 已有2人参与

最近在用PET30a表达了一个蛋白，到了肠激酶酶切这一步卡住了，切了两次了都没切开。

目的蛋白50KDa左右，切除后应该是43kDa左右（His标签大概7kDa），但是蛋白电泳图跟对照和marker都一致在50。

我的蛋白液100ml左右，用了两次100ul的肠激酶了（总共200ul），酶切条件是22°，16h。

各位帮忙分析下原因，谢谢咯。
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1楼 2014-05-23 21:43:39
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-26 09:28:01
一个可能肠激酶失活，要做个正对照
二可能你纯化的蛋白里面有东西影响了酶切，建议将蛋白透析干净后再切
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2楼2014-05-26 09:06:18
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a1059277

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by rodickholm at 2014-05-26 09:06:18
一个可能肠激酶失活，要做个正对照
二可能你纯化的蛋白里面有东西影响了酶切，建议将蛋白透析干净后再切

我是用的梯度透析，最后一步透析液是 20mM Tris，200mM nacl
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3楼2014-05-26 11:05:15
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
常规SDS-PAGE分析不是很直观，建议楼主做一个WB检测下，切前和切后作对照
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爱拼才会赢
4楼2014-05-26 11:14:35
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a1059277

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by anyaxiong at 2014-05-26 11:14:35
常规SDS-PAGE分析不是很直观，建议楼主做一个WB检测下，切前和切后作对照

按理说7Kda的大小应该可以看出来的，酶切后一点差别都没有，别人酶切的都很好。
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5楼2014-05-26 14:45:39
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