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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 求助大肠宿主
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linkv8

银虫 (正式写手)

[求助] 求助大肠宿主

各位亲们，小弟最近实验受阻，眼看马上就要毕业，心中甚是焦虑啊！！！！！

现在实验想尝试大肠杆菌C41(DE3),想好心人儿不吝施舍一些，我可以和您用别的来交换的，谢谢啊，太谢谢啦！！！！！
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1楼 2014-05-21 15:56:55
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miao1991

新虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
12楼2014-05-25 19:10:32
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PI4K

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
linkv8: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-05-26 19:34:45
1. BL21 is different from BL21 DE3, which has lac control to prevent leakage before IPTG induction.
2. Try use pET17 or earlier version and pMal-c5x.
3. Cell: C41 or rosetta Gammii 2
4. For expression: proetein-pET17 in C41. using very riched media,
prepare 10ul overnight culture and add to 500ml media.
start your growth on Friday at room temperature or even low temp.
harvest you pellets on Monday.
For growth under 4C, 1 week.
DON'T ADD ANY IPTG and NO inductioin.

The whole idea is to use the lac leakage to expression the protein with proper fold.

Good luck
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13楼2014-05-26 00:31:41
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普通回帖

huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-22 13:30:32
你说说实验现象，有的时候是或者不用变菌株呢。
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2楼2014-05-21 18:59:26
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-22 13:30:41
linkv8: 金币+8, ★★★很有帮助 2014-05-26 19:37:55
找到了吗？我这里有。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
3楼2014-05-21 20:53:45
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linkv8

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by snoopyzxx at 2014-05-21 20:53:45
找到了吗？我这里有。

太好了，我现在没有找到呢，您有什么需要的吗？我看我们这里有没有
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4楼2014-05-22 16:11:56
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linkv8

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-05-21 18:59:26
你说说实验现象，有的时候是或者不用变菌株呢。

哦，好的。我做的是霉菌里的一段P450基因，它是一段膜蛋白，老板让在大肠中高效表达，做纯化，我现在在BL21，ROSETTA中试过了，表达量少的几乎可以忽略不计，根本纯化不了，蛋白图，老板说不确定没有没有表达。我看文献说用这个宿主是表达膜蛋白的，所以想试试
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5楼2014-05-22 16:30:46
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linkv8 at 2014-05-22 16:30:46
哦，好的。我做的是霉菌里的一段P450基因，它是一段膜蛋白，老板让在大肠中高效表达，做纯化，我现在在BL21，ROSETTA中试过了，表达量少的几乎可以忽略不计，根本纯化不了，蛋白图，老板说不确定没有没有表达。我看 ...

有没有注意阅读框的正确性，是不是你一开始就搞错了，然后还有密码子是不是有问题，有没有优化过，我觉得表达量少这个和菌株应该是没有关系的。而表达活性的高低，才和菌株由关系吧。
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6楼2014-05-22 16:51:28
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linkv8

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-05-22 16:51:28
有没有注意阅读框的正确性，是不是你一开始就搞错了，然后还有密码子是不是有问题，有没有优化过，我觉得表达量少这个和菌株应该是没有关系的。而表达活性的高低，才和菌株由关系吧。...

阅读框架看过了没有错误。密码子优化，我也考虑过，但是可恶的老板说不用优化，郁闷，他现在也是让我自己想该怎么做，他也不会了。
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7楼2014-05-22 18:26:41
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)
★ ★
linkv8(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-22 19:24:07
引用回帖:
7楼: Originally posted by linkv8 at 2014-05-22 18:26:41
阅读框架看过了没有错误。密码子优化，我也考虑过，但是可恶的老板说不用优化，郁闷，他现在也是让我自己想该怎么做，他也不会了。...

我的意思是SD序列到你的ATG的距离是对的，8个碱基左右吧。然后阅读框要对，因为真核细胞有的基因就是很奇葩。密码子不是说rosetta就可以解决的。
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8楼2014-05-22 18:37:11
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

DE3不就是BL21吗？莫非我又菜鸟了？你有加标签吗？
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努力打败一切
9楼2014-05-25 00:40:34
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purRRRRRRRRR

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yangjingjing at 2014-05-25 00:40:34
DE3不就是BL21吗？莫非我又菜鸟了？你有加标签吗？

对于你这种菜鸟我只想说de3是有t7启动子的。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2014-05-25 01:03:37
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