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lilili25

金虫 (初入文坛)

[求助] 肠道内微生物DNA提取后,PCR却无结果已有13人参与

我用试剂盒提取的肠道微生物的DNA,浓度为120ng/ul ,纯度为1.700,但是16s PCR 却没有产物,我用的是细菌通用引物,27f和1492r.模板也进行了稀释,都没有结果。是什么原因?请大家帮帮忙?
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启动子2013

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

27f和1492r通用引物PCR产物在1.5kb左右,所以你的PCR extension time要1.5分钟以上(用Taq酶的话),一般我们用2分钟。我刚做这个的时候就犯了这样的错误。
通往表达的启动子。
13楼2014-06-02 15:55:44
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happy6

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
做个梯度PCR看一下,建议你先用模版做梯度,然后再考虑其他成分。
2楼2014-05-19 08:56:38
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你可以先用C3-V5或者其它的,稍微短一些的片段扩增。另外,你的DNA不知道会不会太浓了,稀释十倍试试。
致良知
3楼2014-05-19 10:26:20
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mizhoulong

木虫 (著名写手)

环境卫生、微生物学

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
做没有阳性对照和阴性对照?会不是是体系和试剂的问题?
排出了试剂的问题,再考虑样品的问题。
环境卫生、微生物学、卫生应急
4楼2014-05-19 12:37:54
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用338f和519r试试,短片段就出来了
ControlMyself
5楼2014-05-19 15:37:49
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lgn07521

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
DNA纯度不好吧? 我PCR之前测DNA纯度都在1.77到1.83之间时感觉比较好! 还有是不是酶失活了?或者,体系有问题,有时候引物加的量也会引起PCR反应没结果的,总之原因很多,具体要自己摸一套适合自己的体系!
6楼2014-05-19 18:42:49
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20093651

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议做个梯度或者采样降落PCR程序扩增,这只有慢慢摸索了
但行好事,莫问前程
7楼2014-05-20 19:42:50
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dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
模板,体系,退火温度,循环设置,各种的都有影响,把你做的体系详细列出来,包括PCR程序,一分析便知。
8楼2014-05-20 20:24:15
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j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果短片段出来了,考虑一下pcr体系的问题

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
修炼ing,当虫仙……
9楼2014-05-21 09:03:46
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xiangchou812

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
模板稀释10倍试试看

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
10楼2014-05-21 20:36:19
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lilili25

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by xiangchou812 at 2014-05-21 20:36:19
模板稀释10倍试试看

我已经做了梯度PCR
11楼2014-05-22 07:43:24
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xiangchou812

木虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by lilili25 at 2014-05-22 07:43:24
我已经做了梯度PCR...

一般我们讲的梯度PCR专指温度梯度吧?
12楼2014-05-22 09:04:20
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zhongzhen

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by lilili25 at 2014-08-19 16:31:45
我用的gc338f和518r的引物P小片段,也没有!我在用试剂盒提DNA时把肠道组织也放进去了。这有没有可能是把肠道组织的DNA提取出来。...

应该不会。楼主,你这个问题解决了没有?我也有这样的问题,我做了阳性对照,排除了PCR体系的问题,但是模板也不知道有什么问题,都是照说明书提的DNA啊。你用的是什么试剂盒啊?
16楼2014-12-24 20:54:08
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wadecao

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

17楼2015-01-04 13:46:49
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lifehuangwei

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

是不是你的基因大部分是宿主的基因~所以很难p
18楼2015-10-28 16:48:19
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