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jasonyuanjx

铜虫 (初入文坛)

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[求助] western blot实验相关求助已有1人参与

本人跨方向做科研，属于新手一枚，现在在学习WB实验技术，请教虫友几个问题，希望细心解答，好答案加金币：
1，SDS-PAGE分离胶浓度的选择：在实验室随便找了几个抗体，想先摸遍WB流程，熟悉方法技术，所以抗体随意选择（目前实验室有220，80，48，25分子量的蛋白抗体供选择），内参选的是GAPDH，通过查阅文献GAPDH分子量是36，我选择80的目的蛋白可以吗？如果选48的会不会和内参太近，影响结果观察。如果选80的蛋白，选择10%的分离胶好，还是12%的分离胶好？
2，分离胶浓度确定后，用多大的电压，跑多场时间为宜？
3，转膜条件怎么选择？

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worktogethertoachieveourdreamandnevergiveup

1楼 2014-05-04 15:42:38

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cedriclin

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1.80的可以啊，可以与内参切开，选用10%，12%的分离胶都可以；
2.浓缩电压80-90V，分离电压110-130V都可以，通常浓缩需要半小时左右marker才会分离，分离胶再跑1小时左右吧，这个不固定，因为每个实验室的仪器，电泳缓冲液什么的都有差别；
3.湿法转膜，150mA恒流转2个小时即可

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