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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 电泳图片和质粒浓度不相符……
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shouhu87

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 电泳图片和质粒浓度不相符…… 已有3人参与

用生工的试剂盒做了一次质粒大提，电泳图片中目的条带很亮，估计质粒浓度约700ug/ml，但是测得的质粒浓度只有200ug/ml，各位大神帮忙看一下。
电泳图中，泳道3是提取的质粒，泳道2是质粒用酚—氯仿抽提后，抽提后发现质粒没有了……

电泳图片和质粒浓度不相符……
图片1.jpg
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1楼 2014-04-02 16:57:10
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流， 2014-04-02 17:44:48
我也出现过这种状况，胶回收后跑电泳很亮的条带，去测浓度只有5ng/ul。可能是nano drop有问题，我感觉测得不是很准。
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shouhu87
2楼2014-04-02 17:17:16
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cm8002

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-02 21:12:37
泳道2抽提的是哪里的质粒呢？直接从菌液里来的？菌液量太小，或者最后溶质粒用的溶液太多；至于测的浓度，不知道你们是用什么仪器检测的，有的很山寨的，结果是不可靠
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shouhu87
3楼2014-04-02 20:52:32
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shouhu87

铁杆木虫 (小有名气)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by cm8002 at 2014-04-02 20:52:32
泳道2抽提的是哪里的质粒呢？直接从菌液里来的？菌液量太小，或者最后溶质粒用的溶液太多；至于测的浓度，不知道你们是用什么仪器检测的，有的很山寨的，结果是不可靠

泳道2 的是我原来提取的质粒，测浓度的时候260/280的数值超过2了，所以我抽提纯化了一下，发现抽提之后质粒没有了，我用1ml质粒溶液做抽提，用80ul溶解的质粒。检测仪器是eppendorf的检测仪……而且我用标准品做过对照，结果偏差不是很大。有时候我在怀疑是不是提取的质粒不够纯影响检测了？
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4楼2014-04-02 20:59:31
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shouhu87

铁杆木虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2014-04-02 17:17:16
我也出现过这种状况，胶回收后跑电泳很亮的条带，去测浓度只有5ng/ul。可能是nano drop有问题，我感觉测得不是很准。

我用同一台仪器检测了DNA标准品，检测结果偏差不是很大……
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5楼2014-04-02 21:01:10
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cm8002

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shouhu87 at 2014-04-02 20:59:31
泳道2 的是我原来提取的质粒，测浓度的时候260/280的数值超过2了，所以我抽提纯化了一下，发现抽提之后质粒没有了，我用1ml质粒溶液做抽提，用80ul溶解的质粒。检测仪器是eppendorf的检测仪……而且我用标准品做过 ...

额，泳道2是一毫升质粒溶液抽提，那之前的1ml应该是大提的产物，肯定电泳检测过不可能没有东西，看来是抽提操作过程中有些问题，质粒没有回收回来；
至于浓度检测，我们之前也用eppendorf的检测仪，它还是挺准的，但关键是你用的比色杯得是新的，不知道你测标准品的时候用的杯子跟后来测样品用的杯子是否一样，如果一样，那就不太清楚了。。。试剂盒大提还是比较纯的
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shouhu87
6楼2014-04-03 14:00:51
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心碎

新虫 (小有名气)
★
shouhu87(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-03 19:15:13
酚氯仿抽提后，用乙酸钠和无水乙醇沉淀，离心应该有的啊，是不是质粒浓度太低，导致检测不到啊，可以冻干后小体积溶解，再走电泳试试看。
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shouhu87
实验顺利，其他都是浮云
7楼2014-04-03 16:57:03
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shouhu87

铁杆木虫 (小有名气)
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引用回帖:
6楼: Originally posted by cm8002 at 2014-04-03 14:00:51
额，泳道2是一毫升质粒溶液抽提，那之前的1ml应该是大提的产物，肯定电泳检测过不可能没有东西，看来是抽提操作过程中有些问题，质粒没有回收回来；
至于浓度检测，我们之前也用eppendorf的检测仪，它还是挺准的， ...

是我抽提技术不过关，今天重新抽提了一下，居然提出来了，只不过抽提的过程损失好大！至于试剂盒大提的纯度我觉得确实不好说。当时测浓度的时候用的是同一个比色杯，用蒸馏水冲洗重复使用的
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8楼2014-04-03 19:06:51
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shouhu87

铁杆木虫 (小有名气)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by 心碎 at 2014-04-03 16:57:03
酚氯仿抽提后，用乙酸钠和无水乙醇沉淀，离心应该有的啊，是不是质粒浓度太低，导致检测不到啊，可以冻干后小体积溶解，再走电泳试试看。

电泳图显示的质粒浓度不低，只是用分光光度计测定DNA浓度的时候得到的结果很低……不知道有什么杂质会影响浓度测定？
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9楼2014-04-03 19:08:21
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2012csc

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

用什么测的质粒浓度？个人觉得电泳跑出来的还是比较可信的~
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坚持就是胜利！
10楼2014-04-27 15:19:51
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