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菜菜0929

木虫 (小有名气)


[交流] 求助怎么设计这样的引物

转录组测序得到基因序列,用OFR finder得到OFR,比对到BLASTP得到了蛋白序列,想要利用这个OFR设计引物来克隆全长,我要怎么设计?有哪些注意事项?
例如OFR:154 atggaccaattctctctagacgagctagcaaatcaattctgggcc
        M  D  Q  F  S  L  D  E  L  A  N  Q  F  W  A
    199 ccatcccccgctggatccggcatcggcccctcctcctccgccgcc
        P  S  P  A  G  S  G  I  G  P  S  S  S  A  A
    244 gtcccgccggccgccatgaaccggagctcctcggagtggttcttc
        V  P  P  A  A  M  N  R  S  S  S  E  W  F  F
    289 gccaagttcctcgaagagggctccgtcaccggcgtcccctcgccg
        A  K  F  L  E  E  G  S  V  T  G  V  P  S  P
    334 aaccccgatccgagtcttaaccagtctgtggattcgttgaagcgc
        N  P  D  P  S  L  N  Q  S  V  D  S  L  K  R
    379 ggaggggacgatgatgtggtcgaaatcaatcggcgggagactgct
        G  G  D  D  D  V  V  E  I  N  R  R  E  T  A
    424 gctgggcaaccgcctcgcagtttcgatcaggtggcgccgctggag
        A  G  Q  P  P  R  S  F  D  Q  V  A  P  L  E
    469 gtggctgacccggtggagcacgcggcgttgctgaagcagaagctg
        V  A  D  P  V  E  H  A  A  L  L  K  Q  K  L
    514 gctatgtgctgtgctgtcgtcgccatgtcttggggttctggtgta
        A  M  C  C  A  V  V  A  M  S  W  G  S  G  V
    559 aaacctcaagattcttcattagctgagagcaggtcacagtcttca
        K  P  Q  D  S  S  L  A  E  S  R  S  Q  S  S
    604 gatccttcacagctgggatctcaaacttttgttgatggagatgct
        D  P  S  Q  L  G  S  Q  T  F  V  D  G  D  A
    649 tctaagatgaaaagtaagacaggtgttgcattgggtggagttccg
        S  K  M  K  S  K  T  G  V  A  L  G  G  V  P
    694 gctccacatttcctgaagaattcagcagcccaagctaagccggca
        A  P  H  F  L  K  N  S  A  A  Q  A  K  P  A
    739 actagtggatcgtcgtcagacgatgacgaccttgaaggagatttg
        T  S  G  S  S  S  D  D  D  D  L  E  G  D  L
    784 gagataacagaaaacatggacccttctgatgcgaaacgtgtaagg
        E  I  T  E  N  M  D  P  S  D  A  K  R  V  R
    829 aggatgctgtcaaatagggaatcagcaagacgctctagaagaaga
        R  M  L  S  N  R  E  S  A  R  R  S  R  R  R
    874 aaacaagaacatttaagtgagcttgaggcacaggtctcacaatta
        K  Q  E  H  L  S  E  L  E  A  Q  V  S  Q  L
    919 agaggtgaaaattcaactttgttaaagcggtttactgacataaat
        R  G  E  N  S  T  L  L  K  R  F  T  D  I  N
    964 ctgaaatacaatgaagctgctgtgaacaatcggatactaaaagct
        L  K  Y  N  E  A  A  V  N  N  R  I  L  K  A
   1009 gatgttgaaactctgagagcgaaggtcaagatggctgaggactca
        D  V  E  T  L  R  A  K  V  K  M  A  E  D  S
   1054 gtgaaaagagttacaggtgggagtcctatgtttccgacgatgtcg
        V  K  R  V  T  G  G  S  P  M  F  P  T  M  S
   1099 gacctttcctcgatcagcatgccattcactgggagtccgtgtgaa
        D  L  S  S  I  S  M  P  F  T  G  S  P  C  E
   1144 gcaagctctgatgctgctgttcctgtccgtgatgacacaaacctc
        A  S  S  D  A  A  V  P  V  R  D  D  T  N  L
   1189 ttcttccaggccccagtgtctgatcagagaattaacagccgacat
        F  F  Q  A  P  V  S  D  Q  R  I  N  S  R  H
   1234 cctcagatgactactgcagctccgccagctgcagttgggggaaac
        P  Q  M  T  T  A  A  P  P  A  A  V  G  G  N
   1279 ataggtggggctgtagccagcttggagcacctgcagagcaggatc
        I  G  G  A  V  A  S  L  E  H  L  Q  S  R  I
   1324 tccggaggaccggtctcgggcggtgcaggacagtgggatgctgct
        S  G  G  P  V  S  G  G  A  G  Q  W  D  A  A
   1369 gcagggtggaaccctggtacatcgatgaacaaggaatga 1407   
        A  G  W  N  P  G  T  S  M  N  K  E  *


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+1  154 .. 1407 1254

[ Last edited by 菜菜0929 on 2013-12-30 at 15:23 ]
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lidonghong

金虫 (正式写手)


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菜菜0929: 金币+3 2014-01-01 14:05:51
引用回帖:
13楼: Originally posted by 菜菜0929 at 2014-01-01 08:27:08
我的目的是用测序得到的序列找到ORF,再利用ORF设计引物,扩出全长,可行吗?怎么设计
...

是可行的,将测得的序列利用一个在线网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/sequence-analysis/就可以预测他的ORF,然后再设计全长扩增引物。
15楼2014-01-01 08:54:39
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)


★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
菜菜0929: 金币+5 2014-01-01 14:05:09
引物R 5‘跟OFR 3’对齐,引物F 5‘跟OFR5’对齐
16楼2014-01-01 10:01:13
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gyl121

新虫 (正式写手)


★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
菜菜0929: 金币+5 2014-01-02 09:12:54
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-01-29 17:13:57
你这个引物,我觉得最好是与这个蛋白相关的进行比对,然后根据那个蛋白的DNA序列进行设计引物,因为一般都是在ORF开放阅读框前后设计引物的,如果比较长,可以进行切割,分段设计引物,我同学都是这么做的,当然其后就是10楼的步骤了,祝好
17楼2014-01-01 19:03:25
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普通回帖
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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2楼2013-12-29 12:33:09
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achonghello

金虫 (正式写手)


★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
菜菜0929: 金币+1 2013-12-29 15:03:23
先去NCBI上比对出相似序列再比较着用DNAman什么的设计
3楼2013-12-29 12:47:09
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菜菜0929

木虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by nono2009 at 2013-12-29 12:33:09
专业问题建议去相关专业版交流

什么版块啊

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2013-12-29 15:02:46
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菜菜0929

木虫 (小有名气)


怎么没人回答?
6楼2013-12-30 16:33:32
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lidonghong

金虫 (正式写手)


★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引物设计很简单的,但首先要搞清你的目的,然后primer5.0,立马出来
7楼2013-12-30 17:33:31
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)


★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
菜菜0929: 金币+5 2013-12-31 12:22:03
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-31 15:56:25
gyesang: 回帖置顶 2013-12-31 15:56:27
内容已删除
10楼2013-12-31 12:16:12
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菜菜0929

木虫 (小有名气)


引用回帖:
10楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2013-12-31 12:16:12
有引物设计软件就行。扩全长,引物一定在ORF两端,基本没什么选择余地。BLAST检测你的引物的特异性,2个引物的Tm值尽量接近。

所谓一定在ORF两端,是怎么个衡量方法呢?把ORF复制到PRIMER5,我的到得分数较高的引物不是在两端的,我要手动把它移过去吗?那样分数低怎么办?会有二聚体、发卡架构什么的。在两端是要引物3‘跟OFR 3’对齐,引物5‘跟OFR5’对齐的意思吗?
11楼2013-12-31 12:27:13
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)


引用回帖:
11楼: Originally posted by 菜菜0929 at 2013-12-31 12:27:13
所谓一定在ORF两端,是怎么个衡量方法呢?把ORF复制到PRIMER5,我的到得分数较高的引物不是在两端的,我要手动把它移过去吗?那样分数低怎么办?会有二聚体、发卡架构什么的。在两端是要引物3‘跟OFR 3’对齐,引物 ...

你有得选择吗?
12楼2013-12-31 17:34:32
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菜菜0929

木虫 (小有名气)


引用回帖:
7楼: Originally posted by lidonghong at 2013-12-30 17:33:31
引物设计很简单的,但首先要搞清你的目的,然后primer5.0,立马出来

我的目的是用测序得到的序列找到ORF,再利用ORF设计引物,扩出全长,可行吗?怎么设计

[ 发自小木虫客户端 ]
13楼2014-01-01 08:27:08
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菜菜0929

木虫 (小有名气)


引用回帖:
12楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2013-12-31 17:34:32
你有得选择吗?...

什么意思呢?选择什么

[ 发自小木虫客户端 ]
14楼2014-01-01 08:32:30
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菜菜0929

木虫 (小有名气)


引用回帖:
17楼: Originally posted by gyl121 at 2014-01-01 19:03:25
你这个引物,我觉得最好是与这个蛋白相关的进行比对,然后根据那个蛋白的DNA序列进行设计引物,因为一般都是在ORF开放阅读框前后设计引物的,如果比较长,可以进行切割,分段设计引物,我同学都是这么做的,当然其后 ...

我的开放阅读框1000多的话需要分割吗

[ 发自小木虫客户端 ]
18楼2014-01-02 09:14:10
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gyl121

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by 菜菜0929 at 2014-01-02 09:14:10
我的开放阅读框1000多的话需要分割吗
...

看你们实验室怎么做,以及你是扩增DNA的话,那个是有内含子的,肯定不只是你说的1000bp 了,要好长的,我同学的就一直在切,然后设计引物,测序,祝好
19楼2014-01-02 19:45:15
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菜菜0929

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引用回帖:
19楼: Originally posted by gyl121 at 2014-01-02 19:45:15
看你们实验室怎么做,以及你是扩增DNA的话,那个是有内含子的,肯定不只是你说的1000bp 了,要好长的,我同学的就一直在切,然后设计引物,测序,祝好...

非常感谢

[ 发自小木虫客户端 ]
20楼2014-01-03 07:23:57
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林川4楼
2013-12-29 12:57   回复  
2013-12-30 19:11   回复  
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5楼: Originally posted by 菜菜0929 at 2013-12-29 15:02:46 什么版块啊 ...

sjmr12219楼
2013-12-30 19:38   回复  
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