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sapeter

金虫 (正式写手)

[求助] 请教,细胞染色的问题已有2人参与

不知道该不该发到这里,本人是做高分子的,材料表征需要做细胞实验,刚刚开始,我们用的染料主要是DAPI和A488,都是比较常见的,但实际操作起来没有想象的顺利,有些问题想请教一下:

1 DAPI 如果没有和细胞核内的DNA结合会出现蓝色荧光么?我们经常在样品上看到一些蓝色的点,感觉像是染料残余,而不是细胞核,怀疑是不是自己没洗干净。
2 A488 染的到底是什么?为什么同样的操作步骤同样的染料,有时候能染上有时候就染不上呢?与什么因素有关?

谢谢!
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aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by sapeter at 2013-12-20 04:41:33
是的,通透过的。就是看到一些蓝色的点,不知道染料残留会不会产生这样的效果,还是细胞核的效果。但是觉得大小不均匀,而且形状也是多边形的。...

这是我们染的固定通透之后的细胞
请教,细胞染色的问题
DAPI.jpg

身体健康,工作顺利
11楼2013-12-20 15:31:58
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aoda123

木虫 (正式写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by czcpudai at 2013-12-22 07:01:20
您好,我最近打算做这个荧光染色的实验,但是不知道相关的步骤,我看到您的帖子发的照片,做的挺不错的,能不能给指点一下,这个实验的具体步骤是怎么样的?多谢了!...

爬片的细胞用PBS轻轻洗两三遍,4%多聚甲醛固定10min,PBST洗3遍,用1%的triton X-100通透10min,PBST洗三遍,再用1::10000的DAPI染色10min,再用PBST洗干净就好了
身体健康,工作顺利
13楼2013-12-22 16:13:51
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daibingling

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-19 09:16:43
a488染料我没用过。DAPI染色后,必须充分振摇冲洗,否则是很容易残留。DAPI染色最理想的就是细胞核被染成蓝色的小亮点。
2楼2013-12-19 08:54:01
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aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-19 09:16:47
DAPI染死细胞的话,很好染。活细胞的话,会有残留
身体健康,工作顺利
3楼2013-12-19 08:57:53
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sapeter

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by daibingling at 2013-12-19 08:54:01
a488染料我没用过。DAPI染色后,必须充分振摇冲洗,否则是很容易残留。DAPI染色最理想的就是细胞核被染成蓝色的小亮点。

那残留的DAPI会发出蓝色荧光么?DAPI是不是只有与细胞核结合后才会发出荧光?还是本身也有荧光?
作茧自缚,期待破茧成蝶。
4楼2013-12-20 04:25:18
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sapeter

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by aoda123 at 2013-12-19 08:57:53
DAPI染死细胞的话,很好染。活细胞的话,会有残留

染料在细胞外的残留与活死有关系么?我染的都是用甲醛固定的细胞,死透了的。
作茧自缚,期待破茧成蝶。
5楼2013-12-20 04:37:07
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sapeter

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by aoda123 at 2013-12-19 08:57:53
DAPI染死细胞的话,很好染。活细胞的话,会有残留

染料在细胞外的残留与活死有关系么?我染的都是用甲醛固定的细胞,死透了的。
作茧自缚,期待破茧成蝶。
6楼2013-12-20 04:37:52
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daibingling

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by sapeter at 2013-12-20 04:25:18
那残留的DAPI会发出蓝色荧光么?DAPI是不是只有与细胞核结合后才会发出荧光?还是本身也有荧光?...

残留的会看见一片蓝色
7楼2013-12-20 08:59:31
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aoda123

木虫 (正式写手)

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5楼: Originally posted by sapeter at 2013-12-19 22:37:07
染料在细胞外的残留与活死有关系么?我染的都是用甲醛固定的细胞,死透了的。...

如果用多聚甲醛固定并通透以后,DAPI稀释(1:10000)常温染色5min就能染得很好
身体健康,工作顺利
8楼2013-12-20 09:32:56
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aoda123

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by sapeter at 2013-12-19 22:37:07
染料在细胞外的残留与活死有关系么?我染的都是用甲醛固定的细胞,死透了的。...

用0.1%triton X-100通透5-10min
身体健康,工作顺利
9楼2013-12-20 09:42:56
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sapeter

金虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by aoda123 at 2013-12-20 09:42:56
用0.1%triton X-100通透5-10min...

是的,通透过的。就是看到一些蓝色的点,不知道染料残留会不会产生这样的效果,还是细胞核的效果。但是觉得大小不均匀,而且形状也是多边形的。
作茧自缚,期待破茧成蝶。
10楼2013-12-20 10:41:33
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