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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教，细胞染色的问题
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sapeter

金虫 (正式写手)

[求助] 请教，细胞染色的问题 已有2人参与

不知道该不该发到这里，本人是做高分子的，材料表征需要做细胞实验，刚刚开始，我们用的染料主要是DAPI和A488，都是比较常见的，但实际操作起来没有想象的顺利，有些问题想请教一下：

1 DAPI 如果没有和细胞核内的DNA结合会出现蓝色荧光么？我们经常在样品上看到一些蓝色的点，感觉像是染料残余，而不是细胞核，怀疑是不是自己没洗干净。
2 A488 染的到底是什么？为什么同样的操作步骤同样的染料，有时候能染上有时候就染不上呢？与什么因素有关？

谢谢！
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作茧自缚，期待破茧成蝶。
1楼 2013-12-19 02:26:14
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aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by sapeter at 2013-12-20 04:41:33
是的，通透过的。就是看到一些蓝色的点，不知道染料残留会不会产生这样的效果，还是细胞核的效果。但是觉得大小不均匀，而且形状也是多边形的。...

这是我们染的固定通透之后的细胞
请教，细胞染色的问题
DAPI.jpg
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身体健康，工作顺利
11楼2013-12-20 15:31:58
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aoda123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by czcpudai at 2013-12-22 07:01:20
您好，我最近打算做这个荧光染色的实验，但是不知道相关的步骤，我看到您的帖子发的照片，做的挺不错的，能不能给指点一下，这个实验的具体步骤是怎么样的?多谢了！...

爬片的细胞用PBS轻轻洗两三遍，4%多聚甲醛固定10min，PBST洗3遍，用1%的triton X-100通透10min，PBST洗三遍，再用1：:10000的DAPI染色10min，再用PBST洗干净就好了
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身体健康，工作顺利
13楼2013-12-22 16:13:51
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daibingling

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-19 09:16:43
a488染料我没用过。DAPI染色后，必须充分振摇冲洗，否则是很容易残留。DAPI染色最理想的就是细胞核被染成蓝色的小亮点。
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2楼2013-12-19 08:54:01
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aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-19 09:16:47
DAPI染死细胞的话，很好染。活细胞的话，会有残留
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3楼2013-12-19 08:57:53
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sapeter

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by daibingling at 2013-12-19 08:54:01
a488染料我没用过。DAPI染色后，必须充分振摇冲洗，否则是很容易残留。DAPI染色最理想的就是细胞核被染成蓝色的小亮点。

那残留的DAPI会发出蓝色荧光么？DAPI是不是只有与细胞核结合后才会发出荧光？还是本身也有荧光？
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作茧自缚，期待破茧成蝶。
4楼2013-12-20 04:25:18
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sapeter

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by aoda123 at 2013-12-19 08:57:53
DAPI染死细胞的话，很好染。活细胞的话，会有残留

染料在细胞外的残留与活死有关系么？我染的都是用甲醛固定的细胞，死透了的。
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作茧自缚，期待破茧成蝶。
5楼2013-12-20 04:37:07
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sapeter

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by aoda123 at 2013-12-19 08:57:53
DAPI染死细胞的话，很好染。活细胞的话，会有残留

染料在细胞外的残留与活死有关系么？我染的都是用甲醛固定的细胞，死透了的。
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作茧自缚，期待破茧成蝶。
6楼2013-12-20 04:37:52
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daibingling

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sapeter at 2013-12-20 04:25:18
那残留的DAPI会发出蓝色荧光么？DAPI是不是只有与细胞核结合后才会发出荧光？还是本身也有荧光？...

残留的会看见一片蓝色
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7楼2013-12-20 08:59:31
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aoda123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sapeter at 2013-12-19 22:37:07
染料在细胞外的残留与活死有关系么？我染的都是用甲醛固定的细胞，死透了的。...

如果用多聚甲醛固定并通透以后，DAPI稀释（1:10000）常温染色5min就能染得很好
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身体健康，工作顺利
8楼2013-12-20 09:32:56
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aoda123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sapeter at 2013-12-19 22:37:07
染料在细胞外的残留与活死有关系么？我染的都是用甲醛固定的细胞，死透了的。...

用0.1%triton X-100通透5-10min
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身体健康，工作顺利
9楼2013-12-20 09:42:56
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sapeter

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by aoda123 at 2013-12-20 09:42:56
用0.1%triton X-100通透5-10min...

是的，通透过的。就是看到一些蓝色的点，不知道染料残留会不会产生这样的效果，还是细胞核的效果。但是觉得大小不均匀，而且形状也是多边形的。
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作茧自缚，期待破茧成蝶。
10楼2013-12-20 10:41:33
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