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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] 原生动物DNA提取及PCR问题 已有1人参与

我现在做分子,材料是一种原生动物,按照文献的方法single specimen提的DNA就足够PCR扩增用的,但是没有说DNA浓度是多少。
我提的DNA最大浓度96ng/ul,模板量是4ul,但是PCR除了marker条带就什么也没有了,现在就很头疼不知道是模板浓度太低还是其他原因。想问问哪位前辈也做原生动物的,PCR成功的,您提的DNA浓度最大和最小有多少。
新手上路,问题多多,多谢指教!
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zhouxiaofei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-31 09:47:49
提取主要是考虑DNA的纯度,质量如何?一般的PCR浓度在100ng-1000ng,主要取决于用的那种酶。建议用那种对模版质量要求不高的,就比较合适。还有引物建议优化。
2楼2013-10-31 09:19:04
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxiaofei at 2013-10-31 09:19:04
提取主要是考虑DNA的纯度,质量如何?一般的PCR浓度在100ng-1000ng,主要取决于用的那种酶。建议用那种对模版质量要求不高的,就比较合适。还有引物建议优化。

您说使用对模板质量要求不高的酶,比如是什么呢?我一直用的东盛的Taq酶,您觉得有问题么?
谢谢!
越努力越幸运
3楼2013-11-01 08:10:20
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zhouxiaofei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
柠檬可乐星: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-11-03 10:42:00
比如NEB 的longAmp@ Taq,M0323S,我们用的感觉不错。做鼠尾DNA提取PCR也还不错。
4楼2013-11-01 10:31:53
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
柠檬可乐星: 金币+2 2013-11-03 10:41:37
你是做哪种的,用什么提的DNA,我是做原虫的,最近也不是很顺利,但是师兄做的时候没什么问题,提取的DNA直接跑PCR,50的体系一般加2,你可以设置阳性对照,要是阳性对照没问题,那就说明没有吧,我们一般不测浓度了,
may
5楼2013-11-01 12:14:16
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安小米

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你这个模板浓度可以了,但是你的模板PCR之前跑过电泳检测没有啊?
另外引物是否合适?
6楼2014-07-03 14:41:01
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