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Qing岳

银虫 (初入文坛)


[交流] 如何构建质粒以及提取它

我要构建一个质粒,但是基本的方法和过程不是很清楚,需要从最基本的开始,请问大概的步骤是怎么样的啊。。
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hjyxm

木虫 (正式写手)


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送红花一朵
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-10-31 12:42:39
质粒构建一般是:目的序列的扩增---与质粒连接----转化---再提取质粒---鉴定;这个是分子生物学很基础的东西,基本上很多分子生物学书上就有,或者相关的文献!
2楼2013-10-31 09:41:40
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b6122

木虫 (正式写手)


★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-10-31 12:42:48
最好去分子生物学实验室学习10天,就什么都知道了。
3楼2013-10-31 11:46:23
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gan19920717

铁虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
首先你得分别把  含有目的基因和空载克隆载体的菌种养出来,一般过夜,然后用质粒提取试剂盒分别提取他们,pcr你的目的基因,同种酶双酶切载体与目的基因,构建酶连体系,然后你构建出了重组质粒,随后再进行相关鉴定~~  可参考下相关的分子生物学实验手册上有相关的步骤方法
4楼2013-11-02 09:01:15
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众星揽月

新虫 (初入文坛)



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1. 通过PCR扩增目的基因片段
PCR要设计引物,设计引物时要选择合适的同源序列,根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点,PCR的产物要纯化。
2. 酶切
根据引物设计的酶切位点,分别对PCR产物和质粒载体进行酶切,酶切后的产物也要进行回收
3. 连接
通过连接酶将酶切后的PCR产物和质粒载体进行连接
4. 转化
将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a),涂板,培养过夜
5. 挑取单克隆,并鉴定
挑去平板上的单克隆培养,可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序

英格恩 Engreen
5楼2015-09-02 11:37:06
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