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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何构建质粒以及提取它
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Qing岳

银虫 (初入文坛)

[交流] 如何构建质粒以及提取它

我要构建一个质粒，但是基本的方法和过程不是很清楚，需要从最基本的开始，请问大概的步骤是怎么样的啊。。
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hjyxm

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1楼 2013-10-30 15:49:33
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众星揽月

新虫 (初入文坛)
★
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1. 通过PCR扩增目的基因片段
PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。
2. 酶切
根据引物设计的酶切位点，分别对PCR产物和质粒载体进行酶切，酶切后的产物也要进行回收
3. 连接
通过连接酶将酶切后的PCR产物和质粒载体进行连接
4. 转化
将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a），涂板，培养过夜
5. 挑取单克隆，并鉴定
挑去平板上的单克隆培养，可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序

英格恩 Engreen
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5楼2015-09-02 11:37:06
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hjyxm

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-31 12:42:39
质粒构建一般是：目的序列的扩增---与质粒连接----转化---再提取质粒---鉴定；这个是分子生物学很基础的东西，基本上很多分子生物学书上就有，或者相关的文献！
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2楼2013-10-31 09:41:40
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b6122

木虫 (正式写手)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-10-31 12:42:48
最好去分子生物学实验室学习10天，就什么都知道了。
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3楼2013-10-31 11:46:23
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gan19920717

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先你得分别把  含有目的基因和空载克隆载体的菌种养出来，一般过夜，然后用质粒提取试剂盒分别提取他们，pcr你的目的基因，同种酶双酶切载体与目的基因，构建酶连体系，然后你构建出了重组质粒，随后再进行相关鉴定~~  可参考下相关的分子生物学实验手册上有相关的步骤方法
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4楼2013-11-02 09:01:15
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