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Qing岳

银虫 (初入文坛)

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[交流] 如何构建质粒以及提取它

我要构建一个质粒，但是基本的方法和过程不是很清楚，需要从最基本的开始，请问大概的步骤是怎么样的啊。。

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hjyxm

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1楼 2013-10-30 15:49:33

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众星揽月

新虫 (初入文坛)

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1. 通过PCR扩增目的基因片段
PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。
2. 酶切
根据引物设计的酶切位点，分别对PCR产物和质粒载体进行酶切，酶切后的产物也要进行回收
3. 连接
通过连接酶将酶切后的PCR产物和质粒载体进行连接
4. 转化
将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a），涂板，培养过夜
5. 挑取单克隆，并鉴定
挑去平板上的单克隆培养，可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序

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