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wwdxx2004

金虫 (正式写手)

[求助] 求分枝杆菌基因组的提取方法

求分枝杆菌基因组的提取方法
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1楼 2013-10-03 09:18:31
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文库构建

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

细菌基因组DNA的制备
　　一、材料
　　细菌培养物。
　　二、设备
　　移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。
　　三、试剂
　　1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
　　2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。
　　四、操作步骤：
　　1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
　　2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。
　　3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
　　4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
　　5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
　　6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
　　7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。
　　8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。
　　9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。

来自：百博明创（北京）
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5楼2013-10-16 09:52:09
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LOVEMeisq

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wwdxx2004: 金币+1, ★有帮助, 谢谢！ 2013-10-04 11:06:16
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-04 11:07:27
1.灭活的斜面加入2mlTE，取1ml，12 000rpm，5min，弃上清。
2.沉淀物加入565μl的TE缓冲液，吸管反复吹打使之重悬，置于-70℃冰箱中放置过夜。加入5μl蛋白酶K、30μl 10%SDS，混匀，于65℃温育>1h。
3.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀，12000rpm，5min，将上清液转入一只新管中。
4.加入0.6体积冰异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，-20℃静置20min，12000rpm，5min，弃上清。1ml的70%冰乙醇洗涤。
5.12000rpm，5min，弃上清，室温干燥，重溶于40μl的TE缓冲液。
这个是结核分枝杆菌的。
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2楼2013-10-04 10:44:08
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by LOVEMeisq at 2013-10-04 10:44:08
1.灭活的斜面加入2mlTE，取1ml，12 000rpm，5min，弃上清。
2.沉淀物加入565μl的TE缓冲液，吸管反复吹打使之重悬，置于-70℃冰箱中放置过夜。加入5μl蛋白酶K、30μl 10%SDS，混匀，于65℃温育>1h。
3.加入等 ...

请问提过分枝杆菌的质粒吗？用普通细菌质粒提取试剂盒可以吗？还有请问要是做菌落PCR与一般细菌一样吗？谢谢！
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3楼2013-10-04 11:07:23
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LOVEMeisq

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
wwdxx2004: 金币+1, ★有帮助 2013-10-08 14:31:24
可以用磁珠法试试，我也没做过。应该可以。
菌落PCR是直接把菌通过枪头或其他物品转移到PCR体系中，在94℃变性时，细菌一般会被煮裂解，基因组和质粒直接被释放出来作为模板；
普通PCR用的DNA模板是经提纯后的DNA，例如质粒，cDNA、genome等；
由于蛋白和其它杂质干扰的存在，菌落PCR效果一般比普通PCR效果差。
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4楼2013-10-05 12:56:14
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