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15879003030

铜虫 (小有名气)


[交流] 谁做过大肠杆菌电转化的,进来交流下经验呀。

本人用的大肠杆菌电转化感受态是自制的,1mm的bio-rad电击杯,1.5KV 25uF 200欧,
个人电击的经验是:电击杯里加的感受态体积小于50,或者+链接产物10uL的话,电击时很容易电出火花,或者说是爆杯,转质粒或者体积大一些则比较正常(1mm的电击杯)  不知道大家有没有这方面的经验,什么条件什么体积的感受态加到电击杯里效率比较高一些。对感受态浓度有没有什么要求呢?

[ Last edited by 15879003030 on 2013-9-18 at 20:34 ]
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)


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gyesang: 金币+2, 的确,盐离子浓度太高 2013-09-19 13:48:32
—怎么可能加连接产物10ul?   里面全是离子啊。
2楼2013-09-18 20:50:25
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15879003030

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-09-18 20:50:25
—怎么可能加连接产物10ul?   里面全是离子啊。

一般最多加多少链接产物呢。
3楼2013-09-18 21:03:36
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)


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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-19 13:48:40
15879003030: 金币+4 2013-09-20 09:04:06
一般加个1ul差不多了,加10ul要用新过一次小柱子,水洗。
大部分连接用不着电转吧,电转明显没有热激稳定。
4楼2013-09-19 00:12:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-19 13:48:47
15879003030: 金币+3 2013-09-20 09:04:00
一般是40μl感受态,加1-2μl的连接产物。连接产物体积不超过5%。
5楼2013-09-19 00:58:27
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bolysu

禁虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

6楼2013-09-19 10:36:52
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caolichuang

铁虫 (初入文坛)


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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-19 13:48:54
另外电压是不是有点高   一般不是12500v/cm么比较保险   我们用的是2500v/2mm,100ul感受态,10ul连接产物没问题 只是要过柱或者洗过都行
7楼2013-09-19 11:39:01
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caolichuang

铁虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
感受态浓度400ml 菌最后分装10-15管*100ul/管 比较合适吧
8楼2013-09-19 11:41:23
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
浓度据说是稀释1000倍 OD=0.15  我没测试过,反正最后时间常数5ms以上比较好
9楼2013-09-20 02:39:23
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刘仁坤2013

新虫 (小有名气)


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15879003030: 金币+3 2013-09-22 13:42:25
1 电击杯的准备很重要。把电击杯用蒸馏水冲洗,然后再用75%的乙醇冲洗,电击杯倒置在超净工作台中,紫外灯照射和风吹20分钟左右;把电击杯放到冰盒中,用冰埋至电击杯的塑料处,继续吹半小时。
2 自己制作的电转感受态细胞,一定要用冰冷的去离子水多洗几次,防止电弧的产生。
3 连接产物一定要沉淀,去除里面的离子,防止电弧的产生。量最好在1-2微升之间。
4 不要让电击杯内的溶液产生气泡,加入感受态和连接产物后轻轻的在桌子上磕磕电击杯,防止起泡的产生。
5 整个过程不要太慢。控制在一分钟内。
10楼2013-09-22 10:57:05
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