| 查看: 2723 | 回复: 4 | ||
[求助]
求助抗体的蛋白浓度检测方法
|
|
最近从millipore买了人IgM，说明书上写的浓度是1.6mg/ml，到货后我立即取了几ul做了蛋白定量。实验室一直用的是Bradford法做标准曲线做蛋白定量，之前表达的蛋白也都是用这个方法来测的。结果测得的结果吸光度几乎为0.反复测了几次，从多管里取样本来检测都是这个结果。后来在网上查到IgM有个测280nm的公式，浓度=A280/1.18,如果按这个公式来算的话又是和说明书相符的。到底是什么原因呢？ 同时拿自己纯化的兔IgG做了Bradford蛋白定量是4.4mg/ml，如果按A280、A260的公式：浓度=1.45A280-0.74A260来算的话，就到了20mg/ml，这也太假了点。 这又是什么原因呢？？ 求助各位！谢啦 |
回复此楼» 猜你喜欢
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有258人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有1人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 蛋白质的共价修饰的测定的试验方法----凌波丽 个人总结
已经有19人回复
- 间接Elisa测中包被抗原浓度的选择
已经有8人回复
- 羧基荧光微球标记蛋白抗体
已经有22人回复
- 糖化血红蛋白和糖化白蛋白检测
已经有12人回复
- 纯化抗体的两个问题
已经有19人回复
- ELISA同一样品，稀释倍数越高，得到结果越大？为嘛？
已经有16人回复
- 【求助】如何探究两个蛋白质之间的直接或间接相互作用？谢谢！
已经有6人回复
- 抗体非特异性结合
已经有8人回复
- 酶标仪测BSA浓度的方法，不用ELISA法，能经过280nm测量吗？
已经有10人回复
- 有关EMSA（凝胶阻滞）的，是否有aEMSA（高浓度琼脂糖凝胶阻滞）这种技术？
已经有3人回复
- 做WB实验，关于抗体的选择？
已经有5人回复
- 有买过santa cruz 抗体的吗？
已经有7人回复
- 【求助/交流】如何测血清中的抗体浓度？
已经有14人回复
- 【求助/交流】如何除去磷酸化蛋白中残余的ATP
已经有15人回复
- 【交流】求助 血药浓度的测定
已经有10人回复
- 【求助/交流】BSA法测蛋白质浓度的原理和方法
已经有19人回复
- 【求助/交流】求一些常用的配对的抗原抗体
已经有7人回复
- 【求助/交流】蛋白浓度测定 BSA法或适宜方法
已经有5人回复
- 【求助/交流】请教一下，如果做通道蛋白的免疫荧光和WB选哪家的抗体最好
已经有5人回复
- 【求助/交流】含咪唑的蛋白免疫兔子
已经有11人回复
- Western Blot 磷酸化蛋白测定问题
已经有9人回复
hl16010921
木虫 (正式写手)
- 应助: 100 (初中生)
- 金币: 2218.4
- 红花: 8
- 帖子: 343
- 在线: 285.2小时
- 虫号: 2514830
- 注册: 2013-06-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
claire8168(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2013-09-13 09:31:02
感谢参与，应助指数 +1
claire8168(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2013-09-13 09:31:02
| 1.考染法蛋白定量受表面活性剂的浓度影响很大，而抗体保存液中可能含有表面活性剂。2.考染法的灵敏度也不是特别高，检测浓度下限达到25μg/ml，用100ul检测体积，就需2.5ug样品。而一般抗体的总量才100ug左右，你测试的用量已经低于或接近检出限了，所以偏差会比较大。3.该抗体生产时的定量方法应该是测280nm的吸收。所以280吸收法测得相符。4.有时大家不测浓度直接做下面的实验，因为抗体的效价差异大多数时候大于浓度差异。5.电泳法有时是好的办法，而且可以看到样品的纯度，有无杂蛋白。（抗体用ddt或巯基乙醇会轻重链分开，切记） |
2楼2013-09-13 09:21:29
|
谢谢您给的建议，因为我测蛋白浓度是需要做抗体的交联，交联剂加入时是需要计算摩尔比的，所以效价需要测，浓度也需要测。个人觉得280 260算抗体浓度只是一个粗略的结果，其灵敏度应该是低于Bradford法的，并且查阅相关信息后发现bradford法检测蛋白浓度的优势就是其灵敏度和 不受蛋白溶液中某些溶剂的影响。所以按理说bradford法的检测应该更准确。 还有购买的IgM说明书中写就是溶在了PBS+叠氮钠里，难道叠氮钠会影响其检测？ 我的IgG也只是溶在了PBS里，所以更不应该存在什么干扰检测的物质了。电泳确实是一个比较好的办法，我也在想实在解决不了就只能跑SDS-PAGE了，但其只能半定量的得到大概估计的一个浓度，还是没办法做到确定的得到一个具体的数值。 |
3楼2013-09-13 09:42:47
hl16010921
木虫 (正式写手)
- 应助: 100 (初中生)
- 金币: 2218.4
- 红花: 8
- 帖子: 343
- 在线: 285.2小时
- 虫号: 2514830
- 注册: 2013-06-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
|
1.你可以在电泳中多设几个标准蛋白的浓度孔，然后照相用软件定量，建一条标准曲线，估计精度会好很多。2.估计抗体溶液里还有其他成分。3.280法是很粗糙的方法了。如果一定要用Bradford法的话，就延长时间。时间对考染法影响比较大。试试更长时间。4.可以试试BCA法，考染法怕表面活性剂，BCA法怕还原剂。5.交联反应不可能是完全反应的，因此摩尔比不一定关键。6.文章发表时，商业化试剂的原始浓度是被认可的，而LZ自己标定的蛋白浓度是被怀疑的（需提供证据证明）因此标定这个浓度可能只在自己试验时有意义，发文章还的改成抗体标定的浓度，否则遇到叫真的审稿人也是麻烦。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
claire81684楼2013-09-13 10:27:22
5楼2013-09-13 10:53:44
