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claire8168

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助抗体的蛋白浓度检测方法

最近从millipore买了人IgM，说明书上写的浓度是1.6mg/ml，到货后我立即取了几ul做了蛋白定量。实验室一直用的是Bradford法做标准曲线做蛋白定量，之前表达的蛋白也都是用这个方法来测的。结果测得的结果吸光度几乎为0.反复测了几次，从多管里取样本来检测都是这个结果。后来在网上查到IgM有个测280nm的公式，浓度=A280/1.18,如果按这个公式来算的话又是和说明书相符的。到底是什么原因呢？

同时拿自己纯化的兔IgG做了Bradford蛋白定量是4.4mg/ml，如果按A280、A260的公式：浓度=1.45A280-0.74A260来算的话，就到了20mg/ml，这也太假了点。

这又是什么原因呢？？ 求助各位！谢啦
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1楼 2013-09-12 15:48:23
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
claire8168(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2013-09-13 09:31:02
1.考染法蛋白定量受表面活性剂的浓度影响很大，而抗体保存液中可能含有表面活性剂。2.考染法的灵敏度也不是特别高，检测浓度下限达到25μg/ml，用100ul检测体积，就需2.5ug样品。而一般抗体的总量才100ug左右，你测试的用量已经低于或接近检出限了，所以偏差会比较大。3.该抗体生产时的定量方法应该是测280nm的吸收。所以280吸收法测得相符。4.有时大家不测浓度直接做下面的实验，因为抗体的效价差异大多数时候大于浓度差异。5.电泳法有时是好的办法，而且可以看到样品的纯度，有无杂蛋白。（抗体用ddt或巯基乙醇会轻重链分开，切记）
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2楼2013-09-13 09:21:29
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claire8168

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-13 09:21:29
1.考染法蛋白定量受表面活性剂的浓度影响很大，而抗体保存液中可能含有表面活性剂。2.考染法的灵敏度也不是特别高，检测浓度下限达到25μg/ml，用100ul检测体积，就需2.5ug样品。而一般抗体的总量才100ug左右，你测 ...

谢谢您给的建议，因为我测蛋白浓度是需要做抗体的交联，交联剂加入时是需要计算摩尔比的，所以效价需要测，浓度也需要测。个人觉得280 260算抗体浓度只是一个粗略的结果，其灵敏度应该是低于Bradford法的，并且查阅相关信息后发现bradford法检测蛋白浓度的优势就是其灵敏度和 不受蛋白溶液中某些溶剂的影响。所以按理说bradford法的检测应该更准确。 还有购买的IgM说明书中写就是溶在了PBS+叠氮钠里，难道叠氮钠会影响其检测？ 我的IgG也只是溶在了PBS里，所以更不应该存在什么干扰检测的物质了。电泳确实是一个比较好的办法，我也在想实在解决不了就只能跑SDS-PAGE了，但其只能半定量的得到大概估计的一个浓度，还是没办法做到确定的得到一个具体的数值。
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3楼2013-09-13 09:42:47
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hl16010921

木虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by claire8168 at 2013-09-13 09:42:47
谢谢您给的建议，因为我测蛋白浓度是需要做抗体的交联，交联剂加入时是需要计算摩尔比的，所以效价需要测，浓度也需要测。个人觉得280 260算抗体浓度只是一个粗略的结果，其灵敏度应该是低于Bradford法的，并且查阅 ...

1.你可以在电泳中多设几个标准蛋白的浓度孔，然后照相用软件定量，建一条标准曲线，估计精度会好很多。2.估计抗体溶液里还有其他成分。3.280法是很粗糙的方法了。如果一定要用Bradford法的话，就延长时间。时间对考染法影响比较大。试试更长时间。4.可以试试BCA法，考染法怕表面活性剂，BCA法怕还原剂。5.交联反应不可能是完全反应的，因此摩尔比不一定关键。6.文章发表时，商业化试剂的原始浓度是被认可的，而LZ自己标定的蛋白浓度是被怀疑的（需提供证据证明）因此标定这个浓度可能只在自己试验时有意义，发文章还的改成抗体标定的浓度，否则遇到叫真的审稿人也是麻烦。
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claire8168
4楼2013-09-13 10:27:22
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claire8168

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
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4楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-13 10:27:22
1.你可以在电泳中多设几个标准蛋白的浓度孔，然后照相用软件定量，建一条标准曲线，估计精度会好很多。2.估计抗体溶液里还有其他成分。3.280法是很粗糙的方法了。如果一定要用Bradford法的话，就延长时间。时间对考 ...

谢谢啦，准备跑个电泳啦
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5楼2013-09-13 10:53:44
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