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[求助]
羧基荧光微球标记蛋白抗体 已有7人参与
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求助：想将羧基化的荧光微球与蛋白抗体连接，最终使用BCA试剂盒检测仅一种抗体连接成功，其他均失败，问题可能出在哪里？ 实验步骤如下： 1.稀释荧光微球 2.加入EDC（终浓度2mM）和NHS（终浓度 5mM），室温反应15min 3.加入2-巯基乙醇（终浓度20mM） 4.离心去上清 5.加入抗体，室温反应4h 6.加入 Tris（终浓度50mM） 7. 离心去上清 8.复溶液复溶 |
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 蛋白质生物学实验经验 | 纳米生物学 | 课题-荧光纳米材料 | 羧基活化EDC,NHS |
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凌波丽
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- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
| 如果荧光微球上有羧基，其与蛋白质的连接非常容易，就是蛋白质分子表面的Asn、Gin的侧链NH2,与荧光微球上的羧基在EDC的催化下形成酰胺键，反应起来很容易不用楼主那么麻烦。EDC活性很高，一般为防止蛋白质损失，只要将两者按一定比例放入烧杯，加上蒸馏水，放在0-4度的冷柜中，过夜即可。反应效果可以离心获得荧光微球沉淀，过滤或者吸走上清液，用红外傅里叶变换光谱分别检测荧光微球、游离的蛋白质和反应后的荧光微球，对比前两者的红外傅里叶变换光谱的叠加与反应后的荧光微球的红外傅里叶变换光谱，后者的红外傅里叶变换光谱与前两者的红外傅里叶变换光谱的并集应该多有重合。 |
10楼2014-08-24 18:25:00
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http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac303204q Approximately 5 mg of MNS or FNS were activated in 100 mM EDC and 100 mM NHS in l mL of 0.01 M PBS (pH 6.8) at room temperature with continuous shaking. After incubating for 30 min, MNS were separated by magnetic force, and FNS by centrifugation, and washed with 0.01 M PBS (pH 7.2) three times. Then, they were dispersed in 1 mL of 0.01 M pH 7.2 PBS to react with 2 mg of NH2−PEG−CM for about 4 h at room temperature with continuous shaking. Afterward, the resultant MNS−PEG−COOH and FNS−PEG−COOH were washed by 0.01 M PBS (pH 7.2) five times to remove any unreacted NH2−PEG−CM. Then, MNS−PEG−COOH and FNS−PEG−COOH were reacted with the antibodies to S. typhimurium (about 50 μg), and the conjugation procedure was similar to that above except that the NH2−PEG−CM were replaced by antibodies |
7楼2013-10-03 11:29:47
18楼2015-08-26 16:38:03
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