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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 羧基荧光微球标记蛋白抗体
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ywhcsy

铜虫 (初入文坛)

[求助] 羧基荧光微球标记蛋白抗体 已有7人参与

求助：想将羧基化的荧光微球与蛋白抗体连接，最终使用BCA试剂盒检测仅一种抗体连接成功，其他均失败，问题可能出在哪里？
实验步骤如下：
1.稀释荧光微球
2.加入EDC（终浓度2mM）和NHS（终浓度 5mM），室温反应15min
3.加入2-巯基乙醇（终浓度20mM）
4.离心去上清
5.加入抗体，室温反应4h
6.加入 Tris（终浓度50mM）
7. 离心去上清
8.复溶液复溶
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do what you think is right
1楼 2013-02-17 10:04:39
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悠悠落叶

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先把微球和NHS放在一起加溶剂，溶解NHS，然后在冰浴下缓慢滴加EDC，可以把EDC先溶解稀释缓慢滴加，然后在慢慢回温，其实加水就可以淬灭EDC了，不需要加巯基乙醇，多臭啊
加入抗体后多反应一点时间，反应个过夜或者8h再试试吧
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4楼2013-02-18 09:44:01
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一步一步

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
问题1：荧光微球的粒径多大？
2：为什么要加2-巯基乙醇？
我做过羧基微球直接与抗体偶联的试验，直接用EDC，偶联效率在95%以上。
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2楼2013-02-17 12:08:36
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ywhcsy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 一步一步 at 2013-02-17 12:08:36
问题1：荧光微球的粒径多大？
2：为什么要加2-巯基乙醇？
我做过羧基微球直接与抗体偶联的试验，直接用EDC，偶联效率在95%以上。

荧光微球粒径210nm
加入巯基乙醇是为了淬灭EDC
曾经试过直接使用EDC耦联    荧光微球聚集
不知能否将一步偶联的步骤发给我再试试
另使用BCA试剂盒评价耦联效率是否可行
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do what you think is right
3楼2013-02-18 08:59:00
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ywhcsy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 悠悠落叶 at 2013-02-18 09:44:01
先把微球和NHS放在一起加溶剂，溶解NHS，然后在冰浴下缓慢滴加EDC，可以把EDC先溶解稀释缓慢滴加，然后在慢慢回温，其实加水就可以淬灭EDC了，不需要加巯基乙醇，多臭啊
加入抗体后多反应一点时间，反应个过夜或者 ...

微球是液态的  有缓冲液
我一般是用缓冲液溶解EDC、NHS到高浓度母液   然后加入少量母液到终浓度
我的缓冲液是水溶液的会不会造成EDC淬灭？
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do what you think is right
5楼2013-02-18 10:06:44
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