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ywhcsy

铜虫 (初入文坛)

[求助] 羧基荧光微球标记蛋白抗体 已有7人参与

求助:想将羧基化的荧光微球与蛋白抗体连接,最终使用BCA试剂盒检测仅一种抗体连接成功,其他均失败,问题可能出在哪里?
实验步骤如下:
1.稀释荧光微球
2.加入EDC(终浓度2mM)和NHS(终浓度 5mM),室温反应15min
3.加入2-巯基乙醇(终浓度20mM)
4.离心去上清
5.加入抗体,室温反应4h
6.加入 Tris(终浓度50mM)
7. 离心去上清
8.复溶液复溶
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do what you think is right
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洋葱头123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

make 一下,后继学习。楼主那个猝灭EDC的做法很是不理解,我做一步法的时候抗体和微球反映过夜之后才加乙醇胺终止过量的EDC.其实我在想,EDC的半衰期那么短,过夜基本上也不会有了吧。楼主是在加抗体前就加了猝灭剂,我觉得有些不对劲。另外应该要注意一下温度吧,真是终止反应建议用乙醇胺,巯基乙醇那么难闻还致癌
9楼2014-05-20 09:33:33
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一步一步

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
问题1:荧光微球的粒径多大?
2:为什么要加2-巯基乙醇?
我做过羧基微球直接与抗体偶联的试验,直接用EDC,偶联效率在95%以上。
2楼2013-02-17 12:08:36
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ywhcsy

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 一步一步 at 2013-02-17 12:08:36
问题1:荧光微球的粒径多大?
2:为什么要加2-巯基乙醇?
我做过羧基微球直接与抗体偶联的试验,直接用EDC,偶联效率在95%以上。

荧光微球粒径210nm
加入巯基乙醇是为了淬灭EDC
曾经试过直接使用EDC耦联    荧光微球聚集
不知能否将一步偶联的步骤发给我再试试
另使用BCA试剂盒评价耦联效率是否可行
do what you think is right
3楼2013-02-18 08:59:00
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悠悠落叶

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
先把微球和NHS放在一起加溶剂,溶解NHS,然后在冰浴下缓慢滴加EDC,可以把EDC先溶解稀释缓慢滴加,然后在慢慢回温,其实加水就可以淬灭EDC了,不需要加巯基乙醇,多臭啊
加入抗体后多反应一点时间,反应个过夜或者8h再试试吧
索马鲁肽,利拉鲁肽,德谷胰岛素,InsulinIcodec胰岛素侧链,发酵索玛/利拉直链热卖
4楼2013-02-18 09:44:01
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