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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酿酒酵母转化
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

[交流] 酿酒酵母转化 已有2人参与

大家做酵母转化时都是这样做的吗？
制备感受态：挑取2-3mm大小单克隆到3ml YPDA 30° 250rpm 震荡培养8-12h------->按1：10000比例转接到50 ml YPDA 培养16-20h OD600=0.15-0.3-------->2500rpm 5min 常温 离心， 用30 ml 无菌水洗一次----------->加入100 ml YPDA 震荡培养3-5小时，OD600=0.4-0.5 -------->将其中50ml 离心，用1.1*LiAC/TE 1.5 ml 重悬，高速离心，去上清，用600 ul 重悬成酵母感受态
转化：担体DNA煮5min 冰水浴 重复一次------>混合5 ul 担体DNA 1ul 质粒 加入500 um PEG/LIAC--------->30° 200rpm 半个小时------>加入20 ul DMSO---------->42° 热休克 期间每隔5分钟混匀一次------->加 YPDA plus 1ml 高速离心，去上清-------->1 ml 0.9% NACL重悬 完毕
    1. 为什么我的菌株在第二次扩培时摇了12个小时OD就达到1.3以上了？然后我就按照那个比例接的菌，例如：本应该OD0.3接到100ml的，也就是一共OD30，所以我的菌如果是OD1.5的话，就接入20ml到100ML的培养基里面。然后就只摇了半个小时就到了OD0.4多了，然后就硬着头皮做了。。。
   2.另外，质粒就只添加1微升吗？还是担体DNA和质粒的比例是5:1就好？
3.30度处理的时候是要摇床吗？我看有的是水浴的，每10-15Min混匀一下，怎样处理比较好呢？
4.大家都用了YPDA吗？就用普通的YPD不行吗？会有什么不一样的结果呢？
5.涂板后都要等上3天菌落直径到2-3mm吗？我的长了一天半就有1mm多了，也可以挑到了，是不是还要再长长呢？
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1楼 2013-08-31 10:14:28
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
。。。。。木有人回复了么
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4楼2013-09-02 16:56:06
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xikexiao

禁虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-31 19:00:09
本帖内容被屏蔽
2楼2013-08-31 16:00:13
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xikexiao at 2013-08-31 16:00:13
1.OD的话1.0-1.3之间是合适的
2.质粒的话1-2u足够
3.最好用摇床
4.普通的YPD即可
5.菌落的话可以挑到即可，一般培养48H

你好，非常感谢你的回答。
1.可是步骤上为什么说OD是0.15-0.3呢?
2.质粒的话，不用管浓度吗?
3.还有感受态可不可以-80度冻起来，继续用啊？每次做那么多就用一点点，有点浪费，做起来也挺麻烦的。。。
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3楼2013-08-31 16:42:49
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yan.007133

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-08-31 16:42:49
你好，非常感谢你的回答。
1.可是步骤上为什么说OD是0.15-0.3呢?
2.质粒的话，不用管浓度吗?
3.还有感受态可不可以-80度冻起来，继续用啊？每次做那么多就用一点点，有点浪费，做起来也挺麻烦的。。。...

1.步骤的话建议参考冷泉港实验室推荐的步骤
3.最好不要冻，现用现做
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5楼2013-09-02 19:16:07
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