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piaoyunokok木虫 (正式写手)
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酿酒酵母转化 已有2人参与
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大家做酵母转化时都是这样做的吗？ 制备感受态：挑取2-3mm大小单克隆到3ml YPDA 30° 250rpm 震荡培养8-12h------->按1：10000比例转接到50 ml YPDA 培养16-20h OD600=0.15-0.3-------->2500rpm 5min 常温 离心， 用30 ml 无菌水洗一次----------->加入100 ml YPDA 震荡培养3-5小时，OD600=0.4-0.5 -------->将其中50ml 离心，用1.1*LiAC/TE 1.5 ml 重悬，高速离心，去上清，用600 ul 重悬成酵母感受态 转化：担体DNA煮5min 冰水浴 重复一次------>混合5 ul 担体DNA 1ul 质粒 加入500 um PEG/LIAC--------->30° 200rpm 半个小时------>加入20 ul DMSO---------->42° 热休克 期间每隔5分钟混匀一次------->加 YPDA plus 1ml 高速离心，去上清-------->1 ml 0.9% NACL重悬 完毕 1. 为什么我的菌株在第二次扩培时摇了12个小时OD就达到1.3以上了？然后我就按照那个比例接的菌，例如：本应该OD0.3接到100ml的，也就是一共OD30，所以我的菌如果是OD1.5的话，就接入20ml到100ML的培养基里面。然后就只摇了半个小时就到了OD0.4多了，然后就硬着头皮做了。。。 2.另外，质粒就只添加1微升吗？还是担体DNA和质粒的比例是5:1就好？ 3.30度处理的时候是要摇床吗？我看有的是水浴的，每10-15Min混匀一下，怎样处理比较好呢？ 4.大家都用了YPDA吗？就用普通的YPD不行吗？会有什么不一样的结果呢？ 5.涂板后都要等上3天菌落直径到2-3mm吗？我的长了一天半就有1mm多了，也可以挑到了，是不是还要再长长呢？ |
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