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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化后的大肠杆菌涂板长不起来
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damon352

禁虫 (初入文坛)
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1楼 2013-08-08 16:28:46
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转基因猴子

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
染菌了，或者平板卡那浓度高了

[ 发自小木虫客户端 ]
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我还年轻，我要上路！
2楼2013-08-08 16:55:48
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖交流！ 2013-08-08 18:32:07
amisking: 回帖置顶 2013-08-08 18:32:09
damon352: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-08-14 16:47:36
转化结束后不能立刻铺板的，因为虽然质粒已经转进去了，但是抗抗生素的蛋白还没有表达出来，所以直接铺板会被抗生素杀死。建议做完转化后，先在不含抗生素的LB液体培养基里摇半小时再铺板。至于为什么在含有抗生素的液体培养基里能生长，我理解是大肠杆菌在液体培养基里肯定比在固体培养基上长的快，在液体培养基里虽然也有被杀死的，还是有存活下来的。
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3楼2013-08-08 17:05:59
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arniekyo

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在液体里面培养的菌能提出质粒么，要是能提出来，说明板子有问题，要是提不出来说明菌液污染
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4楼2013-08-08 18:04:46
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damon352

禁虫 (初入文坛)
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5楼2013-08-08 20:47:30
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-08-10 12:15:29
转化完成之后要用没添加抗生素的液体培养基转摇培养45-60 min，这个过程叫做复苏。刚经历过感受态的细胞比较脆弱，活性很差，不经过复苏的话直接涂在带有抗生素的平板上会被杀死。还有就是你取200 ul涂板没长，而200 ul摇菌却生长了，这个也正常。转化效率低的情况下平板上不一定会有单克隆的生长，但是同样的菌液液体培养可以正常生长。平板上长不出菌可能原因比较多。比如连接效率低，感受态质量不好，转化效率低，复苏时间太少，涂板时涂布棒温度过高等等。建议你转化时同时分50 ul感受态转化一下质粒，比较一下质粒和你的目的产物转化的情况就能大概知道哪一步出问题了。没有对照不好分析实验失败的具体原因。
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6楼2013-08-09 15:14:28
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堍仔

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我帮你总结下，1:复苏时间比较短，这个可能是关键
2：染菌，如果排除第一，这个是主要原因
其他的我觉得操作上应该不会犯很大的错吧，
我们实验室做的克隆是氨苄抗性的，有次氨苄有点失效了，就是液体里面很多菌，但是固体长的很少，而且P下来都测不出来，不知道对楼主有没有参考
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7楼2013-08-11 15:19:39
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