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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)


[求助] ni柱纯化问题已有1人参与

大家好,我最近用金斯瑞的Ni柱纯化我的蛋白(带His6),上样过程会穿过挺多,吸附也较弱(说明书上的缓冲液
Lysis  Equilibration Buffer (LE buffer):   50 mM NaH 2 PO4,   300  mM NaCl, pH  8.0 
Wash  Buffer:    50 mM NaH 2 PO4, 300  mM NaCl, 10 mM imidazole,   pH  8.0 
Elution  buffer:   50 mM NaH 2 PO4, 300  mM  NaCl,  250  mM imidazole, pH 8.0 
就是用10mM咪唑洗杂,我用10mM咪唑基本洗脱了),想问大家,Ni柱有哪些上样方式,可以把柱材和我样品混匀过夜,第二天装柱吗?大家平时还用什么缓冲液效果好,谢谢大家
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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鸡鸣不已: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-08-14 15:07:27
其实NI柱一般是高盐挂柱效果比较好,我们实验室一般都用500mM~1M的NaCl浓度上样,同时,高盐会让核酸直接穿流,这样对下面的实验也不会造成影响。
你也可以让填料和样品在4度轻轻搅拌过夜,之后再装柱,这样结合的会比较好一些。
14楼2013-08-14 14:17:40
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-08-14 14:24:45
麻烦问一下,你们实验室用的缓冲液是tris-hcl还是磷酸盐缓冲液还是什么,我用的是50mM的磷酸二氢钠,300mM nacl溶液,谢谢...

我们一般用TRIS缓冲液,磷酸缓冲液的话,一般用于离子交换柱~
19楼2013-08-14 16:19:35
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gelois

金虫 (正式写手)

引用回帖:
20楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-08-14 18:49:32
怎么正好反过来呢。呵呵,我们离子柱用tris...

其实一般都是用Tris的,只有在Tris分离杂蛋白的效果不好的时候,才会尝试用磷酸缓冲液。
21楼2013-08-15 09:08:50
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