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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 氨氧化细菌PCR结果
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zx1990

金虫 (小有名气)

[求助] 氨氧化细菌PCR结果 已有1人参与

求教诸位大神，我做的安氧化细菌，PCR的结果有很明显的非特异性扩增，根据计算退火温度应该子啊54到56度之间，我做了55,56,57，结果都有非特异性扩增，56度的结果还很明显，不知道有没有人遇到过这种情况，用的引物是amoA1F和amoA2R。我 要做克隆，可不可以忽略非特异性扩增，直接切我的目的片段？
氨氧化细菌PCR结果
退火温度562013-07-23 13hr 00min.jpg
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1楼 2013-07-23 15:03:57
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zx1990

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 秋之静美 at 2014-07-30 10:24:55
你好，你的氨氧化细菌PCR条件摸好了吗？我也再做，同求...

按这个条件，还是有非特异性扩增，只能割胶纯化，做克隆还是可以的
氨氧化细菌PCR结果-1
氨氧化细菌PCR条件.jpg
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10楼2014-08-05 22:12:29
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普通回帖

wwb95599

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议楼主继续提高退火温度，看特异性是否会消失。直接切应该也是可以的，但是个人感觉楼主的胶应该不好切下来。。。
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只要路是对的，就不怕路远．
2楼2013-07-23 15:17:33
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zx1990

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-23 15:17:33
建议楼主继续提高退火温度，看特异性是否会消失。直接切应该也是可以的，但是个人感觉楼主的胶应该不好切下来。。。

一般退火温度可以提高到什么程度呢？
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3楼2013-07-23 18:55:53
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wwb95599

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zx1990 at 2013-07-23 18:55:53
一般退火温度可以提高到什么程度呢？...

做一个梯度，上下１０度都可以，刚开始设计时候可以给温度梯度设计的稍微大些，然后再缩少也可以．
不过楼主要先确定引物设计是否正确，建议先BLAST下．
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只要路是对的，就不怕路远．
4楼2013-07-26 17:05:18
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zx1990

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-26 17:05:18
做一个梯度，上下１０度都可以，刚开始设计时候可以给温度梯度设计的稍微大些，然后再缩少也可以．
不过楼主要先确定引物设计是否正确，建议先BLAST下．...

可否告知具体如何操作才能确定引物正确与否？
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5楼2013-07-27 09:29:06
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

PCR可以采用两步，也就是说退火延伸一起进行。至于你的实验，我看你两条带亮度差不多，所以我估计很难通过提高退火温度来消除非特异条带。不过你完全可以直接回收目的条带进行下游实验，由于两条带大小差异不大，所以建议跑2%的胶，如果还分不清的话，切胶的时候小心，并跳去克隆是做个PCR，看看大小，记得做对照。Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
6楼2013-07-27 11:17:45
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zx1990

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-27 11:17:45
PCR可以采用两步，也就是说退火延伸一起进行。至于你的实验，我看你两条带亮度差不多，所以我估计很难通过提高退火温度来消除非特异条带。不过你完全可以直接回收目的条带进行下游实验，由于两条带大小差异不大，所 ...

嗯，我也是这样做的，结果回收的目标条带浓度很低，没办法做后续的克隆，伤心欲绝，我觉得PCR欺骗了我，明明做20ul体系条带挺亮的，结果做到40ul就不亮了
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7楼2013-07-28 07:57:23
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swach

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主，你好，我现在也要做氨氧化细菌，引物和你选择的一样。不知道你用的反应条件是什么？可以给我分享下吗？我用文献中的条件进行PCR，也出现了两条条带。PCR扩增长度应该是490bp吧，谢谢楼主。
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8楼2014-07-08 18:23:52
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秋之静美

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by swach at 2014-07-08 18:23:52
楼主，你好，我现在也要做氨氧化细菌，引物和你选择的一样。不知道你用的反应条件是什么？可以给我分享下吗？我用文献中的条件进行PCR，也出现了两条条带。PCR扩增长度应该是490bp吧，谢谢楼主。

你好，你的氨氧化细菌PCR条件摸好了吗？我也再做，同求
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9楼2014-07-30 10:24:55
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