24小时热门版块排行榜    

查看: 1916  |  回复: 10

zx1990

金虫 (小有名气)

[求助] 氨氧化细菌PCR结果 已有1人参与

求教诸位大神,我做的安氧化细菌,PCR的结果有很明显的非特异性扩增,根据计算退火温度应该子啊54到56度之间,我做了55,56,57,结果都有非特异性扩增,56度的结果还很明显,不知道有没有人遇到过这种情况,用的引物是amoA1F和amoA2R。我 要做克隆,可不可以忽略非特异性扩增,直接切我的目的片段?
氨氧化细菌PCR结果
退火温度562013-07-23 13hr 00min.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 秋之静美 at 2014-07-30 10:24:55
你好,你的氨氧化细菌PCR条件摸好了吗?我也再做,同求...

按这个条件,还是有非特异性扩增,只能割胶纯化,做克隆还是可以的
氨氧化细菌PCR结果-1
氨氧化细菌PCR条件.jpg

10楼2014-08-05 22:12:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

wwb95599

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议楼主继续提高退火温度,看特异性是否会消失。直接切应该也是可以的,但是个人感觉楼主的胶应该不好切下来。。。
只要路是对的,就不怕路远.
2楼2013-07-23 15:17:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-23 15:17:33
建议楼主继续提高退火温度,看特异性是否会消失。直接切应该也是可以的,但是个人感觉楼主的胶应该不好切下来。。。

一般退火温度可以提高到什么程度呢?
3楼2013-07-23 18:55:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wwb95599

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zx1990 at 2013-07-23 18:55:53
一般退火温度可以提高到什么程度呢?...

做一个梯度,上下10度都可以,刚开始设计时候可以给温度梯度设计的稍微大些,然后再缩少也可以.
不过楼主要先确定引物设计是否正确,建议先BLAST下.
只要路是对的,就不怕路远.
4楼2013-07-26 17:05:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-26 17:05:18
做一个梯度,上下10度都可以,刚开始设计时候可以给温度梯度设计的稍微大些,然后再缩少也可以.
不过楼主要先确定引物设计是否正确,建议先BLAST下....

可否告知具体如何操作才能确定引物正确与否?
5楼2013-07-27 09:29:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

PCR可以采用两步,也就是说退火延伸一起进行。至于你的实验,我看你两条带亮度差不多,所以我估计很难通过提高退火温度来消除非特异条带。不过你完全可以直接回收目的条带进行下游实验,由于两条带大小差异不大,所以建议跑2%的胶,如果还分不清的话,切胶的时候小心,并跳去克隆是做个PCR,看看大小,记得做对照。Good luck!
互助互励,共奋共进!!
6楼2013-07-27 11:17:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-27 11:17:45
PCR可以采用两步,也就是说退火延伸一起进行。至于你的实验,我看你两条带亮度差不多,所以我估计很难通过提高退火温度来消除非特异条带。不过你完全可以直接回收目的条带进行下游实验,由于两条带大小差异不大,所 ...

嗯,我也是这样做的,结果回收的目标条带浓度很低,没办法做后续的克隆,伤心欲绝,我觉得PCR欺骗了我,明明做20ul体系条带挺亮的,结果做到40ul就不亮了
7楼2013-07-28 07:57:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

swach

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主,你好,我现在也要做氨氧化细菌,引物和你选择的一样。不知道你用的反应条件是什么?可以给我分享下吗?我用文献中的条件进行PCR,也出现了两条条带。PCR扩增长度应该是490bp吧,谢谢楼主。
8楼2014-07-08 18:23:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

秋之静美

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by swach at 2014-07-08 18:23:52
楼主,你好,我现在也要做氨氧化细菌,引物和你选择的一样。不知道你用的反应条件是什么?可以给我分享下吗?我用文献中的条件进行PCR,也出现了两条条带。PCR扩增长度应该是490bp吧,谢谢楼主。

你好,你的氨氧化细菌PCR条件摸好了吗?我也再做,同求
9楼2014-07-30 10:24:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zx1990 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 0XLacIJUOj8D 2026-08-24 6/300 2026-08-25 00:11 by BZKMTicpDhFj
[基金申请] 明天应该可查了!? +5 chengyan1220 2026-08-23 5/250 2026-08-24 23:28 by 我4大白菜
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +7 图啦图啦 2026-08-24 8/400 2026-08-24 22:00 by maomao_da
[基金申请] 人气不行了 +10 fansofjerry 2026-08-21 10/500 2026-08-24 21:03 by zhanghaozhu
[基金申请] 我面上完蛋了 +9 且听虎啸 2026-08-20 10/500 2026-08-24 20:08 by 苦寒来香
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +17 羊腰板 2026-08-21 19/950 2026-08-24 16:52 by iaeyuan
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[基金申请] 今日不放榜?网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 21/1050 2026-08-24 14:21 by refreshing11
[基金申请] 估计是周四 +4 archvillain 2026-08-18 4/200 2026-08-24 13:53 by zzuzxg
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +6 炎黄贵胄 2026-08-22 7/350 2026-08-24 11:58 by 6543yes
[基金申请] 朋友圈看到的 +7 wangzilk 2026-08-18 9/450 2026-08-24 10:50 by cmrandy
[基金申请] 让我中一个面上吧! +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 什么时候开奖? +10 CrisMessi 2026-08-18 11/550 2026-08-24 06:50 by 开心的小狮子
[基金申请] 今天放榜吗? +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] 今天基金会出结果吗?20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 重要消息,中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 明天放榜? +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
请填处理意见