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zx1990

金虫 (小有名气)

[求助] 氨氧化细菌PCR结果 已有1人参与

求教诸位大神,我做的安氧化细菌,PCR的结果有很明显的非特异性扩增,根据计算退火温度应该子啊54到56度之间,我做了55,56,57,结果都有非特异性扩增,56度的结果还很明显,不知道有没有人遇到过这种情况,用的引物是amoA1F和amoA2R。我 要做克隆,可不可以忽略非特异性扩增,直接切我的目的片段?
氨氧化细菌PCR结果
退火温度562013-07-23 13hr 00min.jpg
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zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 秋之静美 at 2014-07-30 10:24:55
你好,你的氨氧化细菌PCR条件摸好了吗?我也再做,同求...

按这个条件,还是有非特异性扩增,只能割胶纯化,做克隆还是可以的
氨氧化细菌PCR结果-1
氨氧化细菌PCR条件.jpg

10楼2014-08-05 22:12:29
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普通回帖

wwb95599

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议楼主继续提高退火温度,看特异性是否会消失。直接切应该也是可以的,但是个人感觉楼主的胶应该不好切下来。。。
只要路是对的,就不怕路远.
2楼2013-07-23 15:17:33
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zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-23 15:17:33
建议楼主继续提高退火温度,看特异性是否会消失。直接切应该也是可以的,但是个人感觉楼主的胶应该不好切下来。。。

一般退火温度可以提高到什么程度呢?
3楼2013-07-23 18:55:53
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wwb95599

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zx1990 at 2013-07-23 18:55:53
一般退火温度可以提高到什么程度呢?...

做一个梯度,上下10度都可以,刚开始设计时候可以给温度梯度设计的稍微大些,然后再缩少也可以.
不过楼主要先确定引物设计是否正确,建议先BLAST下.
只要路是对的,就不怕路远.
4楼2013-07-26 17:05:18
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zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-26 17:05:18
做一个梯度,上下10度都可以,刚开始设计时候可以给温度梯度设计的稍微大些,然后再缩少也可以.
不过楼主要先确定引物设计是否正确,建议先BLAST下....

可否告知具体如何操作才能确定引物正确与否?
5楼2013-07-27 09:29:06
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

PCR可以采用两步,也就是说退火延伸一起进行。至于你的实验,我看你两条带亮度差不多,所以我估计很难通过提高退火温度来消除非特异条带。不过你完全可以直接回收目的条带进行下游实验,由于两条带大小差异不大,所以建议跑2%的胶,如果还分不清的话,切胶的时候小心,并跳去克隆是做个PCR,看看大小,记得做对照。Good luck!
互助互励,共奋共进!!
6楼2013-07-27 11:17:45
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zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-27 11:17:45
PCR可以采用两步,也就是说退火延伸一起进行。至于你的实验,我看你两条带亮度差不多,所以我估计很难通过提高退火温度来消除非特异条带。不过你完全可以直接回收目的条带进行下游实验,由于两条带大小差异不大,所 ...

嗯,我也是这样做的,结果回收的目标条带浓度很低,没办法做后续的克隆,伤心欲绝,我觉得PCR欺骗了我,明明做20ul体系条带挺亮的,结果做到40ul就不亮了
7楼2013-07-28 07:57:23
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swach

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主,你好,我现在也要做氨氧化细菌,引物和你选择的一样。不知道你用的反应条件是什么?可以给我分享下吗?我用文献中的条件进行PCR,也出现了两条条带。PCR扩增长度应该是490bp吧,谢谢楼主。
8楼2014-07-08 18:23:52
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秋之静美

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by swach at 2014-07-08 18:23:52
楼主,你好,我现在也要做氨氧化细菌,引物和你选择的一样。不知道你用的反应条件是什么?可以给我分享下吗?我用文献中的条件进行PCR,也出现了两条条带。PCR扩增长度应该是490bp吧,谢谢楼主。

你好,你的氨氧化细菌PCR条件摸好了吗?我也再做,同求
9楼2014-07-30 10:24:55
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