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zx1990

金虫 (小有名气)

[求助] 氨氧化细菌PCR结果 已有1人参与

求教诸位大神,我做的安氧化细菌,PCR的结果有很明显的非特异性扩增,根据计算退火温度应该子啊54到56度之间,我做了55,56,57,结果都有非特异性扩增,56度的结果还很明显,不知道有没有人遇到过这种情况,用的引物是amoA1F和amoA2R。我 要做克隆,可不可以忽略非特异性扩增,直接切我的目的片段?
氨氧化细菌PCR结果
退火温度562013-07-23 13hr 00min.jpg
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wwb95599

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zx1990 at 2013-07-23 18:55:53
一般退火温度可以提高到什么程度呢?...

做一个梯度,上下10度都可以,刚开始设计时候可以给温度梯度设计的稍微大些,然后再缩少也可以.
不过楼主要先确定引物设计是否正确,建议先BLAST下.
只要路是对的,就不怕路远.
4楼2013-07-26 17:05:18
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wwb95599

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议楼主继续提高退火温度,看特异性是否会消失。直接切应该也是可以的,但是个人感觉楼主的胶应该不好切下来。。。
只要路是对的,就不怕路远.
2楼2013-07-23 15:17:33
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zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-23 15:17:33
建议楼主继续提高退火温度,看特异性是否会消失。直接切应该也是可以的,但是个人感觉楼主的胶应该不好切下来。。。

一般退火温度可以提高到什么程度呢?
3楼2013-07-23 18:55:53
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zx1990

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wwb95599 at 2013-07-26 17:05:18
做一个梯度,上下10度都可以,刚开始设计时候可以给温度梯度设计的稍微大些,然后再缩少也可以.
不过楼主要先确定引物设计是否正确,建议先BLAST下....

可否告知具体如何操作才能确定引物正确与否?
5楼2013-07-27 09:29:06
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