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冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)

[求助] 实验要做基因克隆,本人零基础,真诚求助!

本人要克隆鲤鱼丙酮酸激酶(PK)的基因,关于分子生物学的知识只知道些皮毛,目前刚学会在NCBI上查找基因序列:查到了罗非鱼PK的基因组(NT);罗非鱼PK的转录序列1(XM),和转录序列2(XM),这俩个都是mRNA;还有大西洋鲑PK的成熟mRNA序列(NM)。请问接下来该怎么办?是比查找保守序列进行引物设计吗?要不要做RACE?需要提取的是DNA还是总RNA?还是两者都提取?......问题太多了,有些茫然啊,恳请大神给小弟指点迷津,或者是介绍一点有关分子生物学的书籍,小弟感激不尽。
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-19 00:41:57
如果你的序列已经在NCBI上报道过,那就直接根据已报道的序列设计引物P就好了
2楼2013-07-18 22:34:08
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冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-07-18 22:34:08
如果你的序列已经在NCBI上报道过,那就直接根据已报道的序列设计引物P就好了

米有报道啊
3楼2013-07-18 22:45:33
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

没有报道的话,可以分析同源性,如果有保守区域,在保守区域设计简并引物扩增,但是不一定能扩出来
4楼2013-07-19 08:12:38
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
冰糖-葫芦娃: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-20 21:54:08
比对相似生物的同一个基于的保守区,然后设计简并引物P,然后测序,是你要的结果,再做RACE,然后得到基因的全长序列,找出基因的ORF,然后设计全长引物P,再测序,确定克隆基因正确。你搜的其他物种是RNA序列你就提RNA,反之,提DNA。别茫然,不会什么,去学就是了。分子克隆第三版可以看,上面所有分子方面的试验几乎全部都有,方法可以直接使用。
5楼2013-07-19 08:44:49
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冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-07-19 08:44:49
比对相似生物的同一个基于的保守区,然后设计简并引物P,然后测序,是你要的结果,再做RACE,然后得到基因的全长序列,找出基因的ORF,然后设计全长引物P,再测序,确定克隆基因正确。你搜的其他物种是RNA序列你就提 ...

那找相似生物是找哪些呢?是在其他脊椎动物中找?还是只在鱼类中找?怎么比对保守区?比对的是DNA还是RNA?还有什么叫兼并引物?抱歉问题太多了......分子克隆第三版在哪可以下载?多谢
6楼2013-07-19 11:52:38
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